電化學(xué)DNA傳感器（陣列）的研制及其在病原微生物檢測中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的:建立一種檢測病原微生物的絲網(wǎng)印刷型DNA生物傳感器,具有檢測快速、靈敏度高、成本低、制備工藝簡單等特點(diǎn)。本研究采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)制備了傳感電極,通過控制電位法固定DNA探針用于病原微生物的分型及其在樣品中含量的檢測。為樣品中病原微生物含量的快速測定提供了一種快速,靈敏及價(jià)格低廉的檢測技術(shù),也為建立新的微生物分子分型手段提供了初步依據(jù)。
　　方法:本文將單鏈DNA(ssDNA)固定到絲網(wǎng)印刷碳電極上構(gòu)成電化學(xué)DNA傳感器,采用電

2、化學(xué)指示劑,建立DNA雜交的檢測方法。Co(phen)33+電化學(xué)指示劑通過鈷鹽與配體鄰菲羅啉絡(luò)合制備,采用等離子發(fā)射光譜法(ICP-AES)和核磁共振法(NMR)表征功能基團(tuán),采用循環(huán)伏安法(CV)分析指示劑的電化學(xué)特性,并以此為基礎(chǔ)研究ssDNA在電極表面的固定及DNA雜交過程。本文探討了直接吸附、靜電吸附與鍵合等三種ssDNA在電極表面的固定方法。
　　結(jié)果:
　　(1)制備了絲網(wǎng)印刷型傳感電極,該電極制備重復(fù)性好、表

3、面重現(xiàn)性好。作為電化學(xué)檢測的背景信號響應(yīng)較低,且穩(wěn)定。制備了電化學(xué)指示劑Co(phen)33+。通過等離子放射光譜和核磁共振1H譜檢測表明,Co元素和1,10-鄰菲羅啉所發(fā)生的絡(luò)合反應(yīng)正確。在不同修飾電極上的電化學(xué)表征結(jié)果表明,Co(phen)33+在dsDNA修飾電極表面具有更好的吸附效果。
　　(2)靜電吸附法和鍵合法具有較高的ssDNA固定量,采用靜電吸附法固定探針的電極雜交目標(biāo)DNA后,Co(phen)33+易于嵌入雙鏈D

4、NA(dsDNA)中,CV峰電流(ip)信號隨目標(biāo)DNA濃度增加。本文采用靜電吸附ssDNA的電極檢測DNA雜交,實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)探針固定液中ssDNA濃度為5 mg/L時(shí),目標(biāo)DNA濃度在6.65×10-8-4.26×10-6 mol/L范圍內(nèi),Co(phen)33+在dsDNA修飾電極上ip值與DNA濃度呈良好的線性關(guān)系,R2為0.9819。
　　(3)通過PCR和凝膠電泳技術(shù)驗(yàn)證了inl A、act A和hly A三個(gè)基因在單增

5、李斯特局上的特異性,以及檢測的敏感性為9.2×102 cfu/mL;通過基因序列的測定和比對,設(shè)計(jì)了act A基因檢測的DNA探針5'- AGT TAC AGA AAG AAA TAA AGA GG-3'。
　　在9.2×101 cfu/mL-9.2×105 cfu/mL濃度范圍內(nèi),繪制了inl A、act A和hly A三個(gè)基因的熒光定量PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線,三條線性的相關(guān)系數(shù)分別為0.987、0.98和0.991。
　　

6、電化學(xué)指示劑MB在DNA雜交之后,對ip的響應(yīng)無法與DNA濃度之間形成比例關(guān)系;采用電化學(xué)指示劑Co(phen)33+成功繪制了DNA雜交檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性方程為y=0.223Ln(x)+3.7843,線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.9871;利用雜交標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品進(jìn)行定量檢測計(jì)算,檢出結(jié)果與熒光定量PCR檢測結(jié)果相符合,誤差均小于10％。
　　結(jié)論:建立了一種用于病原微生物DNA檢測的絲網(wǎng)印刷型傳感器法檢測技術(shù)。該技術(shù)對短鏈DNA和基