Bc幾丁質(zhì)酶表達(dá)類型檢測(cè)及chiB基因上游DR的功能分析.pdf

1、多種芽胞桿菌都可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶(chitinase，簡(jiǎn)稱Chi)。但芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶的表達(dá)方式及調(diào)控機(jī)制目前尚無(wú)定論。本研究首先對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的26株蠟狀芽胞桿菌(Bacillus cereus，簡(jiǎn)稱Bc)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別進(jìn)行培養(yǎng)后，測(cè)定上清幾丁質(zhì)酶活性，比較分析不同培養(yǎng)基中的酶活數(shù)值，確定菌株表達(dá)量及不同表達(dá)類型所占比例。發(fā)現(xiàn)50％的菌株檢測(cè)不到酶活，而在產(chǎn)酶菌株中，76%屬于誘導(dǎo)型，23%屬于組成型。證明蠟狀芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶

2、的表達(dá)方式具有多態(tài)性。
　　 通過(guò)對(duì)保守區(qū)域進(jìn)行PCR，檢測(cè)了Bc菌株中幾丁質(zhì)酶基因的分布。發(fā)現(xiàn)所有Bc菌株中都含有至少一種Chi編碼基因，ChiA與chiB的陽(yáng)性率分別達(dá)到80.8%和96.2%，且兩種基因同時(shí)存在的占總數(shù)的76.9%。證明蠟狀芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶基因廣泛存在。在這一結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用RFLP方法(RestrictionFragment Length Polymorphism)分析PCR檢測(cè)產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)大部分酶切片段

3、的遷移率與已知序列相同，不同Bc菌株該基因序列的同源性很高，說(shuō)明chi基因在Bc基因組中相當(dāng)保守。
　　 根據(jù)幾丁質(zhì)酶表達(dá)類型及基因檢測(cè)結(jié)果，挑選酶活性最高且典型誘導(dǎo)型的菌株Bc53，以及典型的組成型菌株Bc49和Bc79，克隆包含調(diào)節(jié)區(qū)域在內(nèi)的幾丁質(zhì)酶基因。發(fā)現(xiàn)攜帶有chiB53基因的大腸桿菌異源表達(dá)的幾丁質(zhì)酶也能夠明顯抑制小麥赤霉(Gibberella saubinetii)和黑曲霉(Aspergillus niger)孢子

4、的萌發(fā)，證明ChiB具有顯著的抑真菌活性。檢測(cè)chiB在E.coli和Bc9509異源表達(dá)類型，發(fā)現(xiàn)原組成型chiB49和chiB79在E.coli中仍為組成型表達(dá)，而原誘導(dǎo)型chiB53在兩種宿主中也均為組成型表達(dá)。測(cè)序及軟件分析后發(fā)現(xiàn)，前兩者的潛在啟動(dòng)子區(qū)與組成型表達(dá)的蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)15A3菌株chiB基因相似性達(dá)到100%，而與誘導(dǎo)型chiB53的啟動(dòng)子區(qū)有9個(gè)堿基的差異。

5、r>　　 利用軟件對(duì)已克隆的幾丁質(zhì)酶基因上游調(diào)節(jié)序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)chiB53基因上游存在長(zhǎng)度分別為lObp和8bp的兩對(duì)正向重復(fù)序列(direct repeat，DR)。該DR進(jìn)行了部分及全部缺失，并從幾丁質(zhì)酶活性、特異蛋白表達(dá)量以及mRNA豐度三個(gè)水平觀察缺失DR對(duì)基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，缺失部分及全部重復(fù)序列后的3個(gè)△chiB基因轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coil，無(wú)論幾丁質(zhì)酶活性、特異分子量的蛋白表達(dá)量，還是特異mRNA的轉(zhuǎn)錄水平均明顯提高

6、，證明DR是幾丁質(zhì)酶基因在E.coli中異源表達(dá)的負(fù)控制元件，且這種調(diào)控發(fā)生在mRNA水平。
　　 將完整和一系列缺失DR的△chiB53上游調(diào)控區(qū)域與含有報(bào)告基因bgaB的穿梭載體pCB連接，轉(zhuǎn)入芽胞桿菌。缺失后，報(bào)告基因表達(dá)量的沒(méi)有明顯提升，說(shuō)明正向重復(fù)序列對(duì)于chi基因在芽胞桿菌中的表達(dá)無(wú)顯著負(fù)調(diào)控作用。
　　 本研究為生防芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶的表達(dá)方式、生物防治菌種資源的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，以及chi基因調(diào)控機(jī)理的探索提供了有