解淀粉芽孢桿菌barnase-barstar分子調(diào)控系統(tǒng)的構(gòu)建及在煙草花發(fā)育調(diào)控中的應(yīng)用研究.pdf

1、Barnase是一種來源于解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的細胞致死因子，Barstar是Barnase的抑制因子，barnase-barstar構(gòu)成一對分子開關(guān)可以應(yīng)用于基因表達調(diào)控研究。barnase在花序分生組織中由花序分生組織特異啟動子AtREM1啟動表達能夠使花序分生組織細胞死亡從而抑制植物開花，使植物不能進入生殖生長而長期處于營養(yǎng)生長狀態(tài)。barstar的表達可以阻止barnase的致死作

2、用，從而使植物恢復其育性進入生殖生長狀態(tài)產(chǎn)生種子。Barstar由一個嵌合啟動子MRE35S90啟動，該基因的表達受到人工施加化學誘導劑銅離子的控制，當無化學誘導劑時該基因并不轉(zhuǎn)錄表達，當人工添加誘導劑時，該誘導劑與誘導劑作用基因ace1結(jié)合，從而使響應(yīng)啟動子啟動barstar的表達。
　　本試驗所構(gòu)建的植物生殖器官調(diào)控系統(tǒng)可以在特定的時間和空間進行表達，可以根據(jù)人們不同的需要來進行人工控制。
　　本試驗通過培養(yǎng)解淀粉芽孢桿

3、菌，提取基因組，設(shè)計引物，通過PCR的技術(shù)手段獲得了目的基因barnase及其抑制基因barstar;通過種植培養(yǎng)野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)，并通過提取其總基因組DNA，設(shè)計目的基因引物，獲得花序分生組織特異型啟動子AtREM1啟動barnase的表達;通過培養(yǎng)野生豌豆（ViciaLinn），提取總基因組，設(shè)計引物，得到豌豆rbcs3A終止子;培養(yǎng)農(nóng)桿菌通過PCR手段獲得NOS終止子;培養(yǎng)釀酒酵母(Sacch

4、aromycescerevisiae)通過PCR獲得ace1基因;人工合成MRE35S90啟動子和CaMV35S啟動子分別啟動barstar和ace1的表達。
　　將獲得的各基因組合獲得重組表達質(zhì)粒命名為RBCu，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，使用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化優(yōu)質(zhì)煙草品種NC89從而獲得轉(zhuǎn)基因煙草。
　　轉(zhuǎn)基因煙草的檢測采用抗除草劑的篩選、普通PCR檢測目的基因、Southernblot檢測以及實時熒光定量