芽孢桿菌染色體編輯系統(tǒng)構(gòu)建及三種抗真菌物質(zhì)合成的遺傳調(diào)控研究.pdf

1、土傳病原真菌對(duì)經(jīng)濟(jì)作物構(gòu)成的危害和造成的損失是限制現(xiàn)代高效農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。為了克服這種連作生物障礙，土壤消毒劑和化學(xué)農(nóng)藥的使用量越來越大。然而，農(nóng)藥的過度使用引起了廣泛的病原菌耐藥性和嚴(yán)重的環(huán)境污染。化學(xué)農(nóng)藥在土傳植物病害防控方面的缺陷和消費(fèi)者對(duì)無公害或綠色及有機(jī)食物逐漸擴(kuò)大的需求，使得基于拮抗微生物的土傳病害生物防控技術(shù)逐步替代化學(xué)農(nóng)藥而成為更有前景的作物安全管理策略。芽孢桿菌是一種重要的、已被廣泛應(yīng)用的促生和生防菌劑，但目前

2、其遺傳操作系統(tǒng)還不成熟，對(duì)芽孢桿菌抗真菌物質(zhì)合成的遺傳調(diào)控的研究還不夠深入。
　　 本論文建立了一種可以快速高效對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行多次基因改造的染色體編輯系統(tǒng)，研究了三株生防菌枯草芽孢桿菌ATCC6633、多粘類芽孢桿菌SQR21和產(chǎn)綠鏈霉菌ATCC29814產(chǎn)生抗真菌物質(zhì)的分子機(jī)理。
　　 為了配合生防菌基因改良涉及的大量基因重組工作，本論文構(gòu)建了一種基于Beta重組酶和Cre重組酶的芽孢桿菌染色體編輯系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)可以

3、將敲除元件的單鏈PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化菌體實(shí)現(xiàn)基因失活，重組所需的同源臂很短僅70-nt，可以直接由引物提供。初步篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)過42℃培養(yǎng)激活Cre重組酶刪除敲除元件。該系統(tǒng)所用的輔助質(zhì)粒pWY121為溫度敏感質(zhì)粒，50℃培養(yǎng)抑制質(zhì)粒復(fù)制進(jìn)而將其消除。
　　 利用該芽孢桿菌染色體編輯系統(tǒng)對(duì)枯草芽孢桿菌ATCC6633脂肽類抗生素mycosubtilin合成基因簇進(jìn)行刪除，使ATCC6633失去了拮抗真菌的能力，而對(duì)基因ab

4、rB的敲除能顯著提高其mycosubtilin的產(chǎn)量。通過構(gòu)建ATCC6633/Pmyc-lacZ報(bào)告系統(tǒng)篩選ATCC6633染色體cosmid文庫中能誘導(dǎo)該系統(tǒng)在X-gal平板上顯示藍(lán)色的克隆，采用基因敲除和基因表達(dá)等手段最終確定了ComX對(duì)mycosubtilin的合成具有正調(diào)控的作用。
　　 通過對(duì)多粘類芽孢桿菌SQR21進(jìn)行轉(zhuǎn)座誘變，篩選到一株對(duì)病原真菌Fusariumoxysporum完全失去拮抗能力的突變體MUT-8

5、。LC/MS分析確定了MUT-8失去合成拮抗物質(zhì)fusaricidin的能力。通過比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子插入?yún)^(qū)域位于菌株SQR21的fusA上。fusA基因編碼一個(gè)完整的閱讀框，該閱讀框包含有6個(gè)非核糖體合成酶模塊。盡管fusaricidin結(jié)構(gòu)上第六位的氨基酸都被報(bào)道為D-型丙氨酸，基因分析發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)的模塊并沒有使氨基酸發(fā)生異構(gòu)化的組件。推測(cè)模塊6的氨基酸活化域可以直接識(shí)別D-型丙氨酸。通過生物信息學(xué)分析，推測(cè)fusA上游的fusGFEDC

6、B負(fù)責(zé)fusaricidin脂肪酸鏈的合成。利用lacZ報(bào)告系統(tǒng)和凝膠阻滯電泳確定了AbrB能結(jié)合fusaricidin基因簇的啟動(dòng)子Pfus并抑制其表達(dá)。利用芽孢桿菌染色體編輯系統(tǒng)敲除了菌株SQR21的abrB基因，突變體抗真菌能力有明顯的提高。
　　 利用全基因組測(cè)序技術(shù)可以對(duì)產(chǎn)綠鏈霉菌ATCC29814環(huán)脂肽類抗生素laspartomycin的疑似合成基因簇進(jìn)行定位，然而由于缺乏對(duì)該菌進(jìn)行基因突變的遺傳操作工具，對(duì)于該疑似

7、合成基因簇的功能確定和突變分析一直難以實(shí)現(xiàn)。本論文構(gòu)建了自殺型載體pATKK，并建立了相應(yīng)的轉(zhuǎn)化方法，成功敲除了該疑似合成基因簇的lpmC基因。對(duì)應(yīng)的突變體失去了合成laspartomycin的能力，證明疑似合成基因簇參與laspartomycin的合成。將lpmC基因序列與菌株ATCC29814的全基因組序列進(jìn)行比對(duì)與序列分析，發(fā)現(xiàn)laspartomycin合成基因簇長(zhǎng)約60 kb，包含了21個(gè)開放閱讀框。有趣的是laspartomy

8、cin基因簇包含了編碼稀有氨基酸二氨基丁酸(Dab)的dabA，dabB和dabC基因，盡管laspartomycin在結(jié)構(gòu)上并不舍有二氨基丁酸。
　　 結(jié)論:通過轉(zhuǎn)座子隨機(jī)誘變技術(shù)、定向突變技術(shù)以及全基因組測(cè)序等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了mycosubtilin的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子AbrB的抑制和胞外信息素ComX的激活;確定了兩種抗真菌物質(zhì)fusaricidins和laspartomycins的編碼基因簇，利用生物信息學(xué)分析了相關(guān)基因的