1、紅曲菌兩種新的熒光代謝產(chǎn)物的研究;2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇膠體金免疫層析試紙條的研制.pdf

1、紅曲在我國古代也稱“丹曲”，傳統(tǒng)的紅曲是指以大米為原料，接種紅曲菌經(jīng)固體發(fā)酵而成的紅曲米。紅曲在中醫(yī)上具有健脾化食、燥濕化痰、活血化瘀等功效；工業(yè)上常用于制作紅曲米酒和腌漬肉、魚等。紅曲中含有多種代謝產(chǎn)物，例如醇類物質、酶類物質、有機酸、紅曲色素、莫納可林K(Monacolin K，MK)、γ-氨基丁酸(GABA)等。其中大部分代謝產(chǎn)物具有降血壓、降血脂、抗菌、抗氧化和抗癌等重要的生理活性。紅曲菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物成分復雜，雖然已有較多代謝產(chǎn)

2、物被分離和鑒定，如紅曲色素、MK、桔霉素等，但有關紅曲中熒光物質的報道甚少。 本論文的第一部分分離和鑒定了紅曲中兩種新的熒光物質，并對其部分性質進行了研究。主要研究及結果如下： 1采用硅膠柱層析和半制備型HPLC首次分離、純化得到了紅曲中兩種新的熒光物質。兩者的紫外吸收光譜相似，分子量分別為356和384，命名為monasfluore A(MFA)和monasfluore B(MFB)。分別對MFA和MFB進行熒光光譜掃

3、描，確定了兩者的最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為λex=396 nm和λem=460 nm。采用UV、HPLC、LC-MS、LC-MS/MS、HRMS和NMR等手段對MFA和MFB的結構進行了表征。結果發(fā)現(xiàn)MFA為MFB類似物，兩者的基本骨架完全相同，具有相同的多聚酮發(fā)色團結構，兩者之間分子量相差28，只是側鏈相差兩個亞甲基，MFA含有6個碳原子的已基側鏈，而MFB含有8個碳原子的辛基側鏈。這與已知結構的6種紅曲色素相類似，也屬于Azaph

4、ilones類代謝產(chǎn)物。 2首次建立了用HPLC同時測定紅曲樣品中MFA和MFB的方法。采用色譜柱Symmetry C18(5μm，250×4.6 mmI.D.)和乙腈-水(77:23，v/v)流動相作為分離條件；λex=396 nm，λem=460 nm作為熒光檢測器的檢測波長，以自制的MFA和MFB為對照品進行定量分析。其中MFA的線性方程為Y=772.5X-289.2，相關系數(shù)R=0.9994，線性范圍為0.5-10 ng

5、/mL，平均回收率為85.2％，相對標準偏差為4.2％: MFB的線性方程為Y=2376.6X+1346.4，相關系數(shù)R=0.9972，線性范圍為0.25-5 ng/mL，MFB的平均回收率為82.3％，相對標準偏差為5.3％。多次測定的相對標準偏差均小于3％，具有較好的重復性和穩(wěn)定性。采用建立的HPLC方法檢測了經(jīng)20株紅曲菌發(fā)酵的大米，結果發(fā)現(xiàn)不同紅曲菌株發(fā)酵的大米中，MFA和MFB的含量不一，其中含量最高的為13號菌，MFA和MF

6、B的含量分別為81.4 g/kg和26.3 g/kg，而14號菌發(fā)酵的大米中的MFA和MFB含量最低，分別為0.01 g/kg和0.003 g/kg。 3首次對MFA和MFB的強酸和強堿、熱穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性和與BSA相互作用進行了研究。結果發(fā)現(xiàn)，MFA和MFB的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性差，在酸性條件下比堿性條件穩(wěn)定。與MFA相比，MFB與BSA的作用力明顯增強，可能是由于MFB含有更長的側鏈，具有更強的親脂性，與BSA之間的疏水作用更

7、強。 4采用MTT法首次研究了MFA和MFB對人肺癌細胞(A549)、人肝癌細胞(HepG2)和人二倍體細胞(WI-38)增殖的抑制作用，結果發(fā)現(xiàn)MFA和MFB對A549和HepG2細胞有較明顯的抑制作用，而對WI-38細胞抑制相對較弱。MFA和MFB對HepG2細胞抑制的IC50值分別為12.4和7.1μg/mL；MFA和MFB對A549細胞抑制IC50值分別為16.3和10.6μg/mL。MFB對細胞抑制的作用明顯強于MFA

8、，提示可能與兩者的側鏈長度不同有關。關健詞：紅曲菌；熒光物質；分離純化：結構鑒定；穩(wěn)定性 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇( Deoxynivalenol，DON)是一種常見的真菌毒素，廣泛存在于小麥和玉米等谷物及其制品中，對人類和動物構成很大的威脅。目前，有關DON的檢測方法主要有薄層層析法、氣相色譜法(采用電子捕獲檢測器或質譜檢測)、液相色譜法(采用紫外、熒光、質譜或質譜.質譜檢測)和ELISA等。上述方法不僅檢測設備昂貴、樣品前處理復雜

9、、耗時費力，而且需要專業(yè)人員操作，難于在基層普及和推廣，更不適合現(xiàn)場和野外大規(guī)模的快速檢測。 本研究第二部分研制了谷物及其制品中DON的膠體金免疫層析快速檢測試紙條。該試紙條準確靈敏、特異性好、操作簡單、快速，無需昂貴的設備，適合于現(xiàn)場和批量樣品的檢測分析。主要研究及結果如下： 1對金標抗體的制備的主要影響因素進行了研究。采用ELISA測定標記的金標抗體離心后的上清液與參照液中抗體含量，確定了膠體金最佳標記pH值為7.0

10、;采用鹽析滴定法確定了制備金標抗體最適標記抗體量為30μg/mL。 2優(yōu)化了試紙條的工藝條件。選用P40膜作為層析膜；金標抗體的稀釋度為1:3(即稀釋3倍)；P40膜上噴有濃度分別為800μg/mL和1 mg/mL的檢測抗原(DON-CBSA)和羊抗鼠IgG二抗，噴量均為0.74μLtcm;在上樣液中加上0.005％的陰離子表面活性劑，能很好的消除試紙條上金標抗體與檢測抗原之間由于靜電作用而產(chǎn)生的非特異性吸附。 3該試紙

11、條的靈敏度較高，為50 ng/mL;特異性較好，該試紙條與黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、T-2毒素、HT-2毒素和桔霉素未見有交叉反應；穩(wěn)定性較好，25℃至少可保存5-6個月。 4對樣品前處理進行了研究。結果發(fā)現(xiàn)，在本實驗中樣品顆粒大小、不同水質、攪拌時間和不同靜置時間等對試紙條的檢測結果無明顯影響?？紤]到現(xiàn)場快速檢測情況，稱取粉碎1-2 min后的樣品5g，加入100 mL純凈水或自來水提取，用玻璃棒劇烈攪拌2