基于ACP和SSH技術的不同性別尼羅羅非魚遺傳差異分析.pdf

1、羅非魚是世界性的重要水產(chǎn)養(yǎng)殖對象之一，是聯(lián)合國糧農組織向全世界推廣的優(yōu)良養(yǎng)殖魚類，我國羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量居世界第一位，其中尼羅羅非魚養(yǎng)殖最為廣泛。尼羅羅非魚體型、生長速度等性狀方面在雌雄不同性別之間存在較大的差異，雄魚的生長速度約比雌魚快40-50％，而到性成熟時雄魚個體明顯大于雌魚，嚴重影響商品魚的整體出池，降低了尼羅羅非魚產(chǎn)量和質量。另外由于繁殖快、成熟早，尼羅羅非魚在養(yǎng)殖過程中極易出現(xiàn)繁殖過剩、密度過大、群體生長受阻、營養(yǎng)不良、個體過

2、小等不利情況，從而直接影響羅非魚的上市規(guī)格。開展性別控制技術研究，進行全雄羅非魚的育種，具有重要的意義。對于不同性別尼羅羅非魚遺傳差異進行分析，將有助于提高全雄羅非魚的育種效率。
　　利用退火控制引物技術(annealingcontrolprimer)對尼羅羅非魚不同性別肌肉組織差異表達基因進行篩選，選擇20對ACP隨機引物分別對從同等條件下養(yǎng)殖的尼羅羅非魚群體中的雌、雄魚各5尾組成cDNA池進行差異顯示PCR擴增，獲得8個差異表

3、達的ESTs。除3個為未知基因外，其余5個分別為60S核糖體蛋白(RL3)、肌型肌酸激酶M2-CK、小白蛋白β樣蛋白、轉錄因子Sox4、轉錄變體3(LOC100691543)基因。半定量PCR分析各差異表達基因在5對尼羅羅非魚雌雄個體肌肉組織中的表達發(fā)現(xiàn)，篩選到的8個基因在尼羅羅非魚雌雄個體肌肉組織中存在表達差異。對各差異表達基因在尼羅羅非魚雌雄魚不同組織中的表達進行實時定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，8個差異表達基因中ACP3-X、ACP15-X

4、、60S核糖體蛋白（RL3）、肌型肌酸激酶M2-CK、小白蛋白β樣蛋白和轉錄因子Sox4基因在尼羅羅非魚雌魚肌肉組織中的表達均高于雄魚且差異極為顯著(P＜0.01);轉錄變體3(LOC100691543)和ACP6-Y在尼羅羅非魚雄魚肌肉組織中的表達均高于雌魚，且差異極為顯著(P＜0.01)。結果顯示，通過ACP技術獲得了8個可能參與雌雄魚肌肉生長發(fā)育調控的ESTs，可以為進一步篩選雌雄魚肌肉生長發(fā)育相關候選基因提供一些參考。
　

5、　利用SSH技術進行了尼羅羅非魚雌魚(XX)基因組差異基因的篩選，選取尼羅羅非魚雌魚(XX)、超雄魚(YY)各10條尾鰭混合樣組成的基因組DNA池，以雌魚基因組DNA為試驗方(Tester)，以超雄魚基因組DNA為驅動方(Driver)，采用抑制性消減雜交技術，構建了尼羅羅非魚雌魚的基因組DNA消減雜交文庫。在構建的文庫中隨機挑選1000個克隆，并進行擴大培養(yǎng)后進行測序，樣本測序結果消除載體序列、接頭序列和低于100bp的序列后獲得了9

6、42條基因組DNA片段。依據(jù)網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫進行比對，共有125條序列注釋到了結果，序列最長為1229bp，最短為157bp。125個已知基因包括肌鈣蛋白1(calsequestrin1)、胰島素樣生長因子1受體（insulin-likegrowthfactor1receptor-like，IGF-1R）、60S核糖體蛋白L36a(60SribosomalproteinL36a，partial)等基因。對尼羅羅非魚雌魚(XX)消減文庫樣本中所

7、有ESTs進行GO分類發(fā)現(xiàn)，與分子功能分類(MolecularFunction)相關的ESTs中與分子綁定(binding)和催化活性(catalyticactivity)功能相關的ESTs最多。與細胞組成分類(CellularComponent)相關的ESTs主要集中在細胞組成(cellpart)和細胞(cell)功能上。在與生物過程功能分類(BiologicalProcess)相關的ESTs中，與細胞過程(cellularproce

8、ss)和代謝過程(metabolicprocess)相關的最多。KEGGpathway分析后，得知消減雜交文庫中的基因參與了泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitinproteasomepathway)以及胰島素信號通路(Insulinsignalingpathway)等代謝過程。這為進一步研究尼羅羅非魚雌魚(XX)特異性分子標記奠定了基礎。
　　尼羅羅非魚超雄魚(YY)基因組差異基因的篩實驗中，以超雄魚基因組DNA為試驗方(Test

9、er)，以雌魚基因組DNA為驅動方(Driver)，采用抑制性消減雜交技術，構建了尼羅羅非魚超雄魚的基因組DNA消減雜交文庫。在構建的文庫中隨機挑選1000個克隆，并進行擴大培養(yǎng)后進行測序，樣本測序結果消除載體序列、接頭序列和低于100bp的ESTs序列后獲得了924條基因組DNA片段。測序結果在blastx網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫進行比對共有131條序列注釋到了結果，最長為1270bp，最短為166bp。131個已知基因中包括肌球蛋白VIIa樣蛋白

10、(myosin-VIIa-like)、生長分化因子6-a（growthdifferentiationfactor6-a-like）、抗肌萎縮蛋白相關蛋白(utrophin)、驅動蛋白樣蛋白KIF15-A(kinesin-likeproteinKIF15-A-like)、等基因。對尼羅羅非魚超雄魚消減文庫樣本中所有ESTs進行GO分類發(fā)現(xiàn)，與分子功能分類相關的ESTs中與分子綁定和催化活性功能相關的ESTs最多;與細胞組成分類相關的EST

11、s中與細胞組成和細胞功能相關的ESTs數(shù)目最多;與生物過程功能分類相關的ESTs中，與細胞過程和代謝過程相關的ESTs最多。KEGGpathway分析后，得知消減雜交文庫中的基因參與了ABC轉運體通路(ABCtransporters)、TGF-beta信號通路(TGF-betasignalingpathway)、鈣離子信號通道(Calciumsignalingpathway)等代謝過程。為進一步獲得YY型尼羅羅非魚超雄魚特異性標記基因奠