青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞三萜酸積累、分離鑒定及其降糖機(jī)制研究.pdf

1、青錢(qián)柳(Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinsk)為我國(guó)特有的胡桃科青錢(qián)柳屬珍稀瀕危植物，零星分布于我國(guó)南方各省，可用于保健食品、醫(yī)藥、園林綠化、工業(yè)用材等多個(gè)領(lǐng)域。研究表明，青錢(qián)柳葉含三萜、黃酮、多糖、皂苷及各種微量元素等多種功能活性成分，是具有很高利用價(jià)值的天然保健食品資源，但其繁育十分困難，資源稀缺嚴(yán)重制約了其開(kāi)發(fā)利用。
　　 本文研究了青錢(qián)柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及其三萜酸積累規(guī)律，從懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中提取

2、分離出了主要的三萜酸并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，同時(shí)對(duì)其降糖作用效果及機(jī)制進(jìn)行了研究，旨在探索以青錢(qián)柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方式生產(chǎn)三萜酸類(lèi)降糖功能因子的可行性，為深度開(kāi)發(fā)和利用青錢(qián)柳資源、生產(chǎn)三萜酸類(lèi)降糖功能食品提供理論依據(jù)。
　　 以青錢(qián)柳無(wú)菌幼葉誘導(dǎo)愈傷組織，通過(guò)長(zhǎng)期的篩選和繼代培養(yǎng)，獲得了疏松易碎、生長(zhǎng)旺盛、適合于懸浮培養(yǎng)的優(yōu)良愈傷組織，轉(zhuǎn)入懸浮培養(yǎng)后，再經(jīng)反復(fù)的篩選、繼代和優(yōu)化培養(yǎng)條件，建立了良好的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系。該培養(yǎng)體系最佳繼代時(shí)間

3、為接種后第8天，最大細(xì)胞干重產(chǎn)量出現(xiàn)在第10天，最高總?cè)扑岙a(chǎn)量出現(xiàn)在第14天。在保持MS培養(yǎng)基中總氮源濃度及銨態(tài)氮和硝態(tài)氮比例的同時(shí)，將磷酸鹽、鈣離子和鎂離子濃度分別調(diào)整至1.875 mmol·L-1、2 mmol·L-1和2 mmol·L-1，可獲得較高的總?cè)扑岙a(chǎn)量。以三氯化鈰和水楊酸對(duì)懸浮細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，總?cè)扑岙a(chǎn)量分別可提升35.70％和22.31％。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞總?cè)扑?、熊果酸和齊墩果酸產(chǎn)量分別可達(dá)1179.85 mg·L-1

4、、443.64 mg·L-1和159.00 mg·L-1。
　　 本文首次對(duì)青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中的主要三萜酸進(jìn)行了提取、分離和鑒定。以乙酸乙酯為提取溶劑超聲輔助提取懸浮細(xì)胞總?cè)扑?，得率高且雜質(zhì)少，提取物易于純化，優(yōu)化后的主要工藝參數(shù)為提取時(shí)間40 min、提取溫度50℃、料液比1:10，優(yōu)化條件下總?cè)扑崽崛〉寐蔬_(dá)5.56％。經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附、硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠層析、半制備高效液相色譜和重結(jié)晶等分離純化

5、，從總?cè)扑岽痔嵛镏蝎@得了5個(gè)單體三萜酸，經(jīng)HPLC、TLC、RRLC-TOF/MS、1H NMR、13C NMR和DEPT等檢測(cè)分析，化合物Ⅰ-Ⅴ分別被鑒定為熊果酸、齊墩果酸、白樺脂酸、2α-羥基熊果酸、2α-羥基齊墩果酸，其中白樺脂酸和2α-羥基齊墩果酸是首次在青錢(qián)柳中得到分離、鑒定。
　　 本文以3T3-L1脂肪細(xì)胞為模型，在前脂肪細(xì)胞、成熟脂肪細(xì)胞、胰島素抵抗脂肪細(xì)胞多個(gè)層次上進(jìn)行了青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞三萜酸降糖作用效果研

6、究。試驗(yàn)結(jié)果表明：(1)TTA(總?cè)扑?、UA(熊果酸)、OA(齊墩果酸)、BA(白樺脂酸)、CA(2α-羥基熊果酸)對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖沒(méi)有促進(jìn)作用，2.5μg·mL-1 MA(2α-羥基齊墩果酸)有明顯的促進(jìn)作用：(2)TTA、UA、OA、BA對(duì)前脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗沒(méi)有促進(jìn)作用，而CA、MA在濃度為2.5至5μg·mL-1時(shí)有促進(jìn)作用，并且在沒(méi)有胰島素刺激的情況下也能顯著提高葡萄糖消耗；(3)5μg·mL-1的TTA、UA

7、、OA能極顯著地促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化，而5μg·mL-1的CA明顯地抑制分化，BA和MA則基本無(wú)影響；(4)TTA、UA、OA、CA和MA均對(duì)成熟脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗具有較好的促進(jìn)作用，且在無(wú)胰島素存在的條件下也能提升葡萄糖消耗，表明三萜酸促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗可能存在與Ros(羅格列酮)不同的作用機(jī)制；(5)TTA、UA、MA能防止Dex(地塞米松)所誘導(dǎo)的胰島素抵抗的形成，OA和CA雖然不能防止胰島素抵抗形成但能減輕抵抗的程度，而

8、BA對(duì)胰島素抵抗的形成沒(méi)有影響；(6)TTA和UA能改善已經(jīng)形成胰島素抵抗細(xì)胞的抵抗?fàn)顟B(tài)，具有較好的胰島素增敏作用，MA、OA、CA也有一定的增敏效果，但BA對(duì)抵抗?fàn)顟B(tài)沒(méi)有改善作用；(7)各三萜酸在合適的濃度下，均能顯著地減少胰島素抵抗脂肪細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的FFA(游離脂肪酸)的含量，這也可能是三萜酸改善胰島素抵抗、促進(jìn)葡萄糖消耗的作用機(jī)制之一。
　　 在全面研究三萜酸降糖作用效果的基礎(chǔ)上，選擇了效果較好的TTA.7.5μg·m

9、L-1組、UA5μg·mL-1組、OA5μg·mL-1組和MA5μg·mL-1組進(jìn)行進(jìn)一步的降糖機(jī)制研究，通過(guò)檢測(cè)三萜酸對(duì)胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞中PPARγ、CAP、Glut4、Resistin和IRS-1五個(gè)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)關(guān)鍵靶點(diǎn)的mRNA表達(dá)水平，初步探索其作用的分子機(jī)理。試驗(yàn)結(jié)果表明：(1)UA可能通過(guò)兩條途徑增強(qiáng)胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞的胰島素敏感性、促進(jìn)葡萄糖消耗：一是上調(diào)PPARγ及其下游基因Glut4 m

10、RNA的表達(dá)，二是提高IRS-1 mRNA的表達(dá)；(2)OA可能是通過(guò)下調(diào)Resistin mRNA的表達(dá)來(lái)發(fā)揮降糖作用；(3)MA可能通過(guò)提高胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞CAP和IRS-1 mRNA的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)胰島素敏感性、促進(jìn)葡萄糖消耗，雖然MA沒(méi)有表現(xiàn)出促進(jìn)PPARγ mRNA表達(dá)的活性，但還是明顯促進(jìn)了CAP mRNA的表達(dá)，提示CAP的表達(dá)除受PPARγ調(diào)控之外還可能存在其它調(diào)控途徑；(4)TTA為各三萜酸的混合物，其降糖作

11、用的效果和機(jī)制基本上是各三萜酸作用的綜合體現(xiàn)，一是通過(guò)促進(jìn)PPARγ mRNA的表達(dá)來(lái)提高其下游CAP、Glut4 mRNA的表達(dá)；二是上調(diào)IRS-1 mRNA的表達(dá)；(5)青錢(qián)柳三萜酸在改善胰島素抵抗、促進(jìn)葡萄糖消耗上存在與Ros不一樣的作用機(jī)制。
　　 綜上所述可得出如下結(jié)論：(1)青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中含熊果酸、齊墩果酸、白樺脂酸、2α-羥基熊果酸、2α-羥基齊墩果酸五種主要的三萜酸；(2)青錢(qián)柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)可用于熊果酸、齊