青錢柳懸浮培養(yǎng)細胞三萜酸積累、分離鑒定及其降糖機制研究.pdf

1、青錢柳(Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinsk)為我國特有的胡桃科青錢柳屬珍稀瀕危植物，零星分布于我國南方各省，可用于保健食品、醫(yī)藥、園林綠化、工業(yè)用材等多個領(lǐng)域。研究表明，青錢柳葉含三萜、黃酮、多糖、皂苷及各種微量元素等多種功能活性成分，是具有很高利用價值的天然保健食品資源，但其繁育十分困難，資源稀缺嚴重制約了其開發(fā)利用。
　　 本文研究了青錢柳細胞懸浮培養(yǎng)及其三萜酸積累規(guī)律，從懸浮培養(yǎng)細胞中提取

2、分離出了主要的三萜酸并進行了結(jié)構(gòu)鑒定，同時對其降糖作用效果及機制進行了研究，旨在探索以青錢柳細胞懸浮培養(yǎng)方式生產(chǎn)三萜酸類降糖功能因子的可行性，為深度開發(fā)和利用青錢柳資源、生產(chǎn)三萜酸類降糖功能食品提供理論依據(jù)。
　　 以青錢柳無菌幼葉誘導(dǎo)愈傷組織，通過長期的篩選和繼代培養(yǎng)，獲得了疏松易碎、生長旺盛、適合于懸浮培養(yǎng)的優(yōu)良愈傷組織，轉(zhuǎn)入懸浮培養(yǎng)后，再經(jīng)反復(fù)的篩選、繼代和優(yōu)化培養(yǎng)條件，建立了良好的細胞懸浮培養(yǎng)體系。該培養(yǎng)體系最佳繼代時間

3、為接種后第8天，最大細胞干重產(chǎn)量出現(xiàn)在第10天，最高總?cè)扑岙a(chǎn)量出現(xiàn)在第14天。在保持MS培養(yǎng)基中總氮源濃度及銨態(tài)氮和硝態(tài)氮比例的同時，將磷酸鹽、鈣離子和鎂離子濃度分別調(diào)整至1.875 mmol·L-1、2 mmol·L-1和2 mmol·L-1，可獲得較高的總?cè)扑岙a(chǎn)量。以三氯化鈰和水楊酸對懸浮細胞進行誘導(dǎo)，總?cè)扑岙a(chǎn)量分別可提升35.70％和22.31％。懸浮培養(yǎng)細胞總?cè)扑帷⑿芄岷妄R墩果酸產(chǎn)量分別可達1179.85 mg·L-1

4、、443.64 mg·L-1和159.00 mg·L-1。
　　 本文首次對青錢柳懸浮培養(yǎng)細胞中的主要三萜酸進行了提取、分離和鑒定。以乙酸乙酯為提取溶劑超聲輔助提取懸浮細胞總?cè)扑幔寐矢咔译s質(zhì)少，提取物易于純化，優(yōu)化后的主要工藝參數(shù)為提取時間40 min、提取溫度50℃、料液比1:10，優(yōu)化條件下總?cè)扑崽崛〉寐蔬_5.56％。經(jīng)大孔樹脂吸附、硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠層析、半制備高效液相色譜和重結(jié)晶等分離純化

5、，從總?cè)扑岽痔嵛镏蝎@得了5個單體三萜酸，經(jīng)HPLC、TLC、RRLC-TOF/MS、1H NMR、13C NMR和DEPT等檢測分析，化合物Ⅰ-Ⅴ分別被鑒定為熊果酸、齊墩果酸、白樺脂酸、2α-羥基熊果酸、2α-羥基齊墩果酸，其中白樺脂酸和2α-羥基齊墩果酸是首次在青錢柳中得到分離、鑒定。
　　 本文以3T3-L1脂肪細胞為模型，在前脂肪細胞、成熟脂肪細胞、胰島素抵抗脂肪細胞多個層次上進行了青錢柳懸浮培養(yǎng)細胞三萜酸降糖作用效果研

6、究。試驗結(jié)果表明：(1)TTA(總?cè)扑?、UA(熊果酸)、OA(齊墩果酸)、BA(白樺脂酸)、CA(2α-羥基熊果酸)對3T3-L1前脂肪細胞增殖沒有促進作用，2.5μg·mL-1 MA(2α-羥基齊墩果酸)有明顯的促進作用：(2)TTA、UA、OA、BA對前脂肪細胞葡萄糖消耗沒有促進作用，而CA、MA在濃度為2.5至5μg·mL-1時有促進作用，并且在沒有胰島素刺激的情況下也能顯著提高葡萄糖消耗；(3)5μg·mL-1的TTA、UA

7、、OA能極顯著地促進前脂肪細胞分化，而5μg·mL-1的CA明顯地抑制分化，BA和MA則基本無影響；(4)TTA、UA、OA、CA和MA均對成熟脂肪細胞的葡萄糖消耗具有較好的促進作用，且在無胰島素存在的條件下也能提升葡萄糖消耗，表明三萜酸促進成熟脂肪細胞葡萄糖消耗可能存在與Ros(羅格列酮)不同的作用機制；(5)TTA、UA、MA能防止Dex(地塞米松)所誘導(dǎo)的胰島素抵抗的形成，OA和CA雖然不能防止胰島素抵抗形成但能減輕抵抗的程度，而

8、BA對胰島素抵抗的形成沒有影響；(6)TTA和UA能改善已經(jīng)形成胰島素抵抗細胞的抵抗?fàn)顟B(tài)，具有較好的胰島素增敏作用，MA、OA、CA也有一定的增敏效果，但BA對抵抗?fàn)顟B(tài)沒有改善作用；(7)各三萜酸在合適的濃度下，均能顯著地減少胰島素抵抗脂肪細胞培養(yǎng)上清液中的FFA(游離脂肪酸)的含量，這也可能是三萜酸改善胰島素抵抗、促進葡萄糖消耗的作用機制之一。
　　 在全面研究三萜酸降糖作用效果的基礎(chǔ)上，選擇了效果較好的TTA.7.5μg·m

9、L-1組、UA5μg·mL-1組、OA5μg·mL-1組和MA5μg·mL-1組進行進一步的降糖機制研究，通過檢測三萜酸對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞中PPARγ、CAP、Glut4、Resistin和IRS-1五個胰島素信號傳導(dǎo)相關(guān)關(guān)鍵靶點的mRNA表達水平，初步探索其作用的分子機理。試驗結(jié)果表明：(1)UA可能通過兩條途徑增強胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞的胰島素敏感性、促進葡萄糖消耗：一是上調(diào)PPARγ及其下游基因Glut4 m

10、RNA的表達，二是提高IRS-1 mRNA的表達；(2)OA可能是通過下調(diào)Resistin mRNA的表達來發(fā)揮降糖作用；(3)MA可能通過提高胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞CAP和IRS-1 mRNA的表達來增強胰島素敏感性、促進葡萄糖消耗，雖然MA沒有表現(xiàn)出促進PPARγ mRNA表達的活性，但還是明顯促進了CAP mRNA的表達，提示CAP的表達除受PPARγ調(diào)控之外還可能存在其它調(diào)控途徑；(4)TTA為各三萜酸的混合物，其降糖作

11、用的效果和機制基本上是各三萜酸作用的綜合體現(xiàn)，一是通過促進PPARγ mRNA的表達來提高其下游CAP、Glut4 mRNA的表達；二是上調(diào)IRS-1 mRNA的表達；(5)青錢柳三萜酸在改善胰島素抵抗、促進葡萄糖消耗上存在與Ros不一樣的作用機制。
　　 綜上所述可得出如下結(jié)論：(1)青錢柳懸浮培養(yǎng)細胞中含熊果酸、齊墩果酸、白樺脂酸、2α-羥基熊果酸、2α-羥基齊墩果酸五種主要的三萜酸；(2)青錢柳細胞懸浮培養(yǎng)可用于熊果酸、齊