Surfactin生物合成調(diào)控及其工業(yè)發(fā)酵工藝的研究.pdf

1、芽孢桿菌能夠通過非核糖體合成酶簇(NRPs)生物合成多種具有抑菌、表面活性等的脂肽類次級代謝產(chǎn)物。其中以表面活性素surfactin的生物活性和分子合成機制研究最為深入。Surfactin是由SrfA，SrfB，SrfC三個非核糖體合成酶合成的，是目前發(fā)現(xiàn)的降低表面張力能力最強的生物表面活性劑，對其的功能研究發(fā)現(xiàn)它還兼具抗細菌、真菌、病毒和支原體的功能，在石油回收、土壤修復、生物防治、食品、化妝品等工業(yè)領(lǐng)域上有著廣泛的應(yīng)用前景。盡管有著

2、諸多特性和優(yōu)勢，目前關(guān)于surfactin發(fā)酵工藝的研究多集中于實驗室搖瓶和小型生物反應(yīng)器水平，產(chǎn)量有限且培養(yǎng)基成本昂貴，發(fā)酵設(shè)備復雜、分離純化工藝難以工業(yè)化放大生產(chǎn)。
　　在本研究中，以此作為出發(fā)菌株研究surfactin生物合成過程中前體的調(diào)控作用;優(yōu)化設(shè)計出成本低廉、產(chǎn)量較高的工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基，并針對其進行溢流式發(fā)酵工藝的研究;此外在對Yoneda培養(yǎng)基進行優(yōu)化后研究了兩階段通氣控制在surfactin發(fā)酵中的應(yīng)用。主要結(jié)果描

3、述如下:
　　1.研究了氨基酸前體的添加對surfactin生物合成的影響。研究了氨基酸前體分別單獨添加和協(xié)同作用對surfactin生物合成的調(diào)控作用。通過氨基酸篩選實驗發(fā)現(xiàn)賴氨酸和甘氨酸能顯著提高以菌體干重為基準的surfactin生成系數(shù)(YP/X)，二者分別為0.46和0.5，比對照組分別提高39％和51％。在針對surfactin肽環(huán)的組成氨基酸亮氨酸、纈氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和賴氨酸、甘氨酸在不同培養(yǎng)階段的添加對sur

4、factin生產(chǎn)的影響的研究中發(fā)現(xiàn):除谷氨酸外，其余五種氨基酸均能在較低添加濃度(0.75-1mM)時顯著促進菌體生長，該促進作用在發(fā)酵中后期添加時更加顯著。纈氨酸、谷氨酸和天冬氨酸對surfactin產(chǎn)量的提高作用不明顯，纈氨酸嚴重抑制surfactin的生產(chǎn)。通過空間填充實驗設(shè)計對各種氨基酸的添加進行優(yōu)化，最終將surfactin的總產(chǎn)量提高24％，數(shù)據(jù)分析表明各氨基酸之間對于surfactin生產(chǎn)的影響并無交互作用，這首次在發(fā)酵水

5、平上證實了氨基酸前體對surfactin的分子合成機制和調(diào)控作用。
　　2.研究了碳架前體對surfactin生物合成的影響及其與TCA循環(huán)關(guān)系。經(jīng)篩選草酸、琥珀酸鈉、檸檬酸鈉等糖代謝中間體時surfactin的YP/X均高于對照組，顯著提高surfactin的合成效率，首次發(fā)現(xiàn)了surfactin生物合成途徑與TCA循環(huán)聯(lián)系緊密。進一步的添加試驗發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵24h后添加碳架前體能在不同程度上提高surfactin的產(chǎn)量和YP/X。

6、對各碳架進行優(yōu)化設(shè)計并未能顯著提高surfactin的整體產(chǎn)量。
　　3.利用田口方法對surfactin工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化。通過田口方法發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中玉米粉、PO43-和硝酸銨在不同的設(shè)計中對surfactin的生產(chǎn)分別具有極顯著的影響，并就此針對這三個因素進行進一步的實驗設(shè)計，最終取得了高產(chǎn)培養(yǎng)基配方為:玉米粉為35g/L，硝酸銨為15g/L，尿素6g/L，KCl1.47g/L，NaH2PO4·2H2O20mM，CaCl2

7、0.5μM,MgSO4·7H2O0.1mM,FeSO4·7H2O1μM,MnSO4·H2O0.5mM,CuSO4·5H2O12.8μM。該培養(yǎng)基營養(yǎng)全面、成本低廉、pH緩沖能力強，surfactin產(chǎn)量高達2.3g/L，是原始Landy培養(yǎng)基的近2倍，與優(yōu)化后的Landy相比提高15‰且本培養(yǎng)基配方具有較高信噪比，產(chǎn)量穩(wěn)定。此外，根據(jù)當前市場價格計算，可為surfactin生產(chǎn)降低培養(yǎng)基成本40％以上。利用此工業(yè)培養(yǎng)基進行5m3發(fā)酵罐放

8、大發(fā)酵生產(chǎn)，獲得surfactin產(chǎn)量達到4400mg/L。
　　4.建立了surfactin泡沫溢流發(fā)酵中參數(shù)控制與泡沫形成的關(guān)聯(lián)控制。在批次發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)攪拌和通氣速率與細胞生長和surfactin生產(chǎn)有密切關(guān)系。在不同的攪拌和通氣速率控制策略下，surfactin生產(chǎn)呈現(xiàn)出了不同的動態(tài)趨勢。在控制3中，通過控制泡沫溢流速度低于0.7L/h，泡沫中富集的surfactin濃度呈直線上升趨勢，表明可能通過控制攪拌速度和通氣速率提高s

9、urfactin濃縮。在進一步的研究的中發(fā)現(xiàn)攪拌和通氣速率分別對溢流速度和surfactin濃度影響顯著時期是在不同的發(fā)酵階段。Surfactin富集濃度最高出現(xiàn)在發(fā)酵21小時，攪拌速度為150rpm和通氣率是1vvm的條件下。通過補料并控制surfactin泡沫溢流速度在0.2L/h，成功實現(xiàn)了全實現(xiàn)了surfactin的持續(xù)溢流發(fā)酵，并將泡沫中的濃度維持在4000mg/L。
　　5.針對surfactin發(fā)酵進行了Yoneda

10、培養(yǎng)基的優(yōu)化及兩階段通氣控制。通過部分析因?qū)嶒炘O(shè)計篩選出Yoneda培養(yǎng)基中黃豆粉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、硫酸鎂對于Bacillusamyloliquefaciensfmb50產(chǎn)surfactin影響顯著，進一步的正交試驗獲得的優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為黃豆粉100g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氫二鉀9g/L，硫酸鎂0.6g/L，氯化鈣0.1g/L，硫酸亞鐵0.01g/L，硫酸錳0.05g/L。采用該優(yōu)化后培養(yǎng)基生產(chǎn)surfactin，在搖瓶發(fā)