利用工程大腸桿菌生物法合成香葉醇的發(fā)酵工藝研究.pdf

1、香葉醇作為一種廣泛應(yīng)用于香精香料、日化、食品、藥物等領(lǐng)域的無環(huán)單萜烯醇，市場需求旺盛。目前植物提取和化學(xué)合成是香葉醇的兩種主要合成方法，然而這兩種合成方法存在許多問題，如成本高、污染環(huán)境、選擇性差等等，則以廉價、可再生的生物質(zhì)為原料生物法合成香葉醇成為了發(fā)展趨勢。本論文首先構(gòu)建了以葡萄糖為原料，生物法合成香葉醇的工程大腸桿菌;然后在搖瓶水平進行發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，提高香葉醇產(chǎn)量;最后放大到5L發(fā)酵罐水平獲得高產(chǎn)量的香葉醇，并對年

2、產(chǎn)2500噸香葉醇的發(fā)酵生產(chǎn)工藝進行了設(shè)計。
　　論文的主要內(nèi)容和取得的主要結(jié)論包括以下幾個方面:
　　(1)利用分子生物學(xué)技術(shù)，通過在大腸桿菌體內(nèi)表達甲羥戊酸(MVA)生物合成途徑及香葉醇合成酶GES基因，構(gòu)建了以葡萄糖為原料，生物法合成香葉醇的代謝途徑;通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測確定發(fā)酵產(chǎn)物為香葉醇，并建立了香葉醇的氣相色譜(GC)定量檢測方法，得到其定量標(biāo)準曲線。
　　(2)搖瓶水平發(fā)酵條件和發(fā)酵

3、培養(yǎng)基的優(yōu)化:利用單因素的實驗方法進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，優(yōu)化后的發(fā)酵條件為:誘導(dǎo)時間為菌體的OD600nm值1.0左右，誘導(dǎo)劑IPTG濃度為1.0mM，誘導(dǎo)溫度為30℃，pH為6.0，轉(zhuǎn)速為180r/min，并將優(yōu)化條件用于培養(yǎng)基的優(yōu)化實驗中。利用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基:首先運用Plackett-Burman實驗篩選培養(yǎng)基中影響香葉醇產(chǎn)量的關(guān)鍵因素;再運用最陡爬坡法使關(guān)鍵因素的濃度接近最佳響應(yīng)區(qū)域;最后通過中心組合設(shè)計確定了關(guān)鍵因素的最佳

4、濃度及回歸模型。結(jié)果表明，檸檬酸鐵銨、硫酸鎂和微量元素為影響香葉醇產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，培養(yǎng)基中關(guān)鍵組分的最佳濃度為:檸檬酸鐵銨0.13g/L，硫酸鎂17.6mmol/L，微量元素16.7ml/L。優(yōu)化后香葉醇產(chǎn)量從最初的50.12mg/L提高到223.24mg/L，相比初始的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基產(chǎn)量提高到4.45倍。
　　(3)5L發(fā)酵罐水平發(fā)酵工藝的探究:在5L發(fā)酵罐水平建立了香葉醇的發(fā)酵工藝。由于香葉醇具有抑菌性和揮發(fā)性，在發(fā)酵過程中

5、采用雙相發(fā)酵，即發(fā)酵過程中添加萃取劑肉豆蔻酸異丙酯，實現(xiàn)了發(fā)酵和分離的同時進行，最終達到了香葉醇的穩(wěn)定生產(chǎn)。經(jīng)過48h的誘導(dǎo)培養(yǎng)，菌體的OD600nm值為45左右，香葉醇濃度達到2g/L左右，收率為3.5％左右（理論收率28.5％）。
　　(4)對于生物法合成香葉醇的工業(yè)化生產(chǎn)進行了設(shè)計，生產(chǎn)過程采用雙相發(fā)酵，設(shè)計目標(biāo)是年產(chǎn)2500噸香葉醇（純度≥90％），收率達到18％(理論收率28.5％)，設(shè)計主要包括了工藝的設(shè)計與計算、主要