全國(guó)食品中蠟樣芽孢桿菌的污染分布規(guī)律及遺傳多樣性研究.pdf

1、蠟樣芽抱桿菌（Bacilluscereus，Bc）是一種常見的食源性致病菌，食物暴露空氣中24h以上極易被蠟樣芽抱桿菌污染，引起B(yǎng)c食物中毒的多為乳制品、米飯等食品。目前，對(duì)于Bc在食品中的污染情況，國(guó)內(nèi)外都有大量研究，但國(guó)內(nèi)研究的調(diào)查食品種類僅集中在原料奶、奶制品、淀粉類、餐廳熟食等食品，對(duì)于蔬菜、生肉、食用菌、水產(chǎn)品類食品的研究鮮有報(bào)道。本文研究了深圳、韶關(guān)、湛江、汕頭、河源、?？凇⑷齺?、北海、南寧、福州、廈門、上海、合肥、南昌、武

2、漢、成都、昆明、蘭州、哈爾濱、西安、太原、北京和濟(jì)南23個(gè)城市零售的肉與肉制品、水產(chǎn)品、速凍食品、食用菌、熟食、蔬菜和奶制品7類食品中蠟樣芽孢桿菌的污染狀況，同時(shí)以廣東省收集的菌株為研究對(duì)象開展了毒力相關(guān)基因的鑒定，并構(gòu)建了Bc腸桿菌基因間重復(fù)共有序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(enterobacterialrepetitiveintergenicconsensussequencepolymerasechainreaction，ERIC-PCR)分

3、型技術(shù)，研究其遺傳多樣性，為食品安全的預(yù)防和控制提供依據(jù)。得到以下主要結(jié)論:
　　 1、1150份樣品中，共269份檢出Bc，平均檢出率為23.4％。7類食品中均存在Bc污染現(xiàn)象，Bc陽(yáng)性在肉與肉制品、水產(chǎn)品、速凍食品、食用菌、熟食、蔬菜和奶制品的平均檢出率分別為22.6％、17.0％、23.4％、21.7％、26.1％、40.4％、17.1％，蔬菜類食品被Bc污染的平均比例明顯高于其他食品樣品;Bc在不同城市的污染程度也各不相

4、同，污染率依次為合肥(48.0％)＞濟(jì)南(40.0％)＞蘭州(38.0％)＞北海(36.0％)=廈門(36.0％)＞北京(34.0％)＞太原(30.0％)＞汕頭(26.0％)=哈爾濱(26.0％)＞武漢(24.0％)=深圳(24.0％)＞韶關(guān)(22.0％)=福州(22.0％)=西安(22.0％)＞三亞(20.0％)=成都(20.0％)＞河源(16.0％)＞海口(12.0％))=南寧(12.0％))＞上海(10.0％)＞湛江(8.0％)＞

5、南昌(6.0％)=昆明(6.0％);從采樣場(chǎng)所分析，超市檢出率為23.7％，集市檢出率為23.2％;Bc在食品中的污染水平不高，43.5％的陽(yáng)性樣品MPN值介于3～100MPN/g，7.8％的介于100～1000MPN/g，僅有9.7％的大于1000MPN/g。
　　 2、為進(jìn)一步探索食源性致病菌Bc和在生物防治中的應(yīng)用越來越廣泛的與Bc高度同源的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)的毒力情況，本研

6、究以在廣東地區(qū)分離的47株Bc和62株Bt的菌株為研究對(duì)象，用PCR方法鑒定了9種毒力相關(guān)基因，包括1個(gè)調(diào)節(jié)基因plcR、7個(gè)腸毒素(3個(gè)溶血性基因hblC、hblD、hblA，3個(gè)非溶血基因nheA、nheB、nheC和1個(gè)腸毒素T基因bceT)和1個(gè)嘔吐毒素基因ces。鑒定結(jié)果如下:plcR、hblC、hblD、hblA、nheA、nheB、nheC、bceT、ces在Bc中的檢出率分別為100.0％、59.6％、95.7％、100

7、.0％、100.0％、100.0％、100.0％、85.1％、2.1％，在Bt中的檢出率分別為98.4％、60.7％、98.4％、100.0％、100.0％、98.4％、100.0％、88.7％、0.0％。其中3株(6.4％)Bc和7株(11.3％)Bt可檢出6種毒力相關(guān)基因，21株Bc(44.7％)和22株(35.5％)Bt可檢出7種毒力相關(guān)基因，22株(46.8％)Bc和33株(53.2％)Bt可檢出8種，1株(2.1％)Bc可檢測(cè)

8、出9種。
　　 3、ERIC-PCR是一種相對(duì)簡(jiǎn)單、可靠的、成本經(jīng)濟(jì)、可得到清晰穩(wěn)定的DNA指紋圖譜的分型方法。為建立一種適合Bc的ERIC-PCR反應(yīng)體系，本研究以Bc標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC63303為研究對(duì)象，通過單因素試驗(yàn)對(duì)影響ERIC-PCR擴(kuò)增結(jié)果的主要影響因子模板DNA濃度、Mg2+濃度、引物濃度、TaqDNA聚合酶用量、dNTPs濃度及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上又進(jìn)行了五因素四水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化和方差分析，最后得到的B

9、cERIC-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系為:25μL反應(yīng)體系中含75.00ngDNA模板、5.00mmol/LMg2+、0.20μmol/L引物、TaqDNA聚合酶0.75U、0.40mmol/LdNTPs最佳退火溫度為45℃。
　　 4、為進(jìn)一步研究Bc分離株的遺傳多樣性，以從廣東地區(qū)分離的50株Bc分離株為研究對(duì)象，運(yùn)用建立的ERIC-PCR反應(yīng)條件對(duì)其進(jìn)行分型，50株分離株可分為47個(gè)型，分辨力DI為0.996，相似系數(shù)在0.50-