擬南芥硝態(tài)氮調(diào)控基因NRG3的克隆與功能鑒定.pdf

1、氮素是植物生長發(fā)育所必需的重要營養(yǎng)成分,它參與了植物生長過程中的很多生理過程,如促進(jìn)根的生長、調(diào)節(jié)植物發(fā)育等。目前,已研究發(fā)現(xiàn)幾個(gè)硝態(tài)氮調(diào)控基因,其中 NRT1.1被證明是一個(gè)硝態(tài)氮的感應(yīng)子,在硝酸感應(yīng)和運(yùn)輸方面起重要作用;NLP7是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,可以與響應(yīng)硝酸的順式元件結(jié)合來對(duì)硝態(tài)氮進(jìn)行調(diào)控。但是由于發(fā)現(xiàn)的硝態(tài)氮調(diào)控基因還很少,關(guān)于硝態(tài)氮調(diào)控的分子機(jī)制的研究還不夠深入。
　　本研究利用新建立的硝態(tài)氮調(diào)控突變體篩選系統(tǒng)找到一個(gè)新的

2、突變體,在受硝酸誘導(dǎo)后,其響應(yīng)硝態(tài)氮的信號(hào)明顯比野生型弱。利用圖位克隆的方法克隆出了突變基因,發(fā)現(xiàn)該基因所在家族共有15個(gè)成員,整個(gè)家族所有成員的功能都尚未被鑒定出來,我們將該基因命名為NRG3。
　　利用NRG3的兩個(gè)T-DNA插入突變體株系對(duì)這個(gè)基因進(jìn)行研究,當(dāng)突變體在琥珀酸銨培養(yǎng)基上生長7天并經(jīng)KNO3處理2小時(shí)后,硝酸誘導(dǎo)基因的誘導(dǎo)量顯著低于野生型,表明NRG3是一個(gè)新的硝態(tài)氮調(diào)控基因。在琥珀酸銨培養(yǎng)基生長6天、氮饑餓處理

3、1天后,同樣用KNO3處理2小時(shí),突變體中硝酸誘導(dǎo)基因的誘導(dǎo)量與野生型中的誘導(dǎo)量無顯著差別。對(duì)根中的硝酸含量測(cè)定后發(fā)現(xiàn),突變體中硝酸含量要比野生型中低,而突變體葉中的硝酸含量與野生型相比則沒有明顯差別。
　　利用qPCR和GUS報(bào)告基因?qū)RG3的組織定位進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)NRG3主要表達(dá)在根和葉的維管組織中,在花和莖中也有表達(dá),在維管組織中則主要表達(dá)在木質(zhì)部薄壁細(xì)胞及韌皮部。用GFP融合蛋白對(duì)NRG3的亞細(xì)胞定位分析得知,NRG3蛋

4、白主要表達(dá)在細(xì)胞核中。
　　實(shí)驗(yàn)利用單、雙突變體和qPCR法研究了NRG3和NRT1.1的關(guān)系。NRT1.1和NRG3的雙突變體熒光表現(xiàn)與單突變體中熒光弱的類似,這說明這兩個(gè)基因?qū)τ谙鯌B(tài)氮調(diào)控的作用是不能疊加的,它們?cè)谝粭l信號(hào)通路上影響硝態(tài)氮的調(diào)控。定量結(jié)果顯示,在NRG3的突變體中NRT1.1的表達(dá)量下降,而NRG3在NRT1.1基因的突變體中表達(dá)量沒有變化,所以我們推斷,NRG3位于NRT1.1基因的上游,NRG3調(diào)控NRT1

5、.1的表達(dá)。
　　本實(shí)驗(yàn)又繼續(xù)研究了NRG3和NLP7的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因的雙突變體熒光亮度比單突變體都弱。利用酵母雙雜和BiFC實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),NLP7與NRG3存在互作關(guān)系。據(jù)此我們推測(cè),NRG3能與NLP7互作,并都在調(diào)控硝態(tài)氮信號(hào)響應(yīng)的不同途徑中發(fā)揮重要作用。
　　鑒于NRG3基因在植物輸導(dǎo)組織中表達(dá)量較高,本研究又檢測(cè)了硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因在突變體中的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),NRT1.8的表達(dá)量升高,而且NRG3的表達(dá)與NRT1.8的