果樹根系硝態(tài)氮信號(hào)響應(yīng)關(guān)鍵基因的克隆與功能分析.pdf

1、本試驗(yàn)以桃實(shí)生苗[Prunuspersica(Linn.)Batsch.]為試材，利用高通量數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)技術(shù)，檢測(cè)了NO3-處理后桃苗根系轉(zhuǎn)錄組的變化，并對(duì)表達(dá)發(fā)生顯著變化的關(guān)鍵基因進(jìn)行克隆與遺傳轉(zhuǎn)化、分析功能，主要研究結(jié)果如下：
　　 以10mmolL-1NO3-(N1)處理桃實(shí)生苗[生長(zhǎng)于0.5mmolL-1NO3-(C3)桃苗為對(duì)照]，30min后取新根提取RNA，通過高通量數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)進(jìn)行基因表達(dá)

2、分析，結(jié)果表明：1，707個(gè)基因產(chǎn)生響應(yīng)。在N1中有460個(gè)基因的表達(dá)被上調(diào)；有1，247個(gè)基因的表達(dá)被下調(diào)。通過pathway分析發(fā)現(xiàn)，N1中有909個(gè)基因響應(yīng)NO3-。其中81(8.91％)個(gè)基因參與氮同化和氨基酸代謝。參與氮吸收代謝和信號(hào)調(diào)控的基因[硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(NRT)，MYB、DDF和GATA類轉(zhuǎn)錄因子，蔗糖非發(fā)酵-1型蛋白激酶基因(SnRK1)和CIPK8/23同源基因]的表達(dá)發(fā)生了變化。除了參與碳、氮信號(hào)和代謝的基因

3、，NO3-還影響參與次生代謝物的生物合成、植物-病原體互作和植物生長(zhǎng)發(fā)育等過程基因的表達(dá)。
　　 從桃樹新根克隆了PpDOF1，GenBank注冊(cè)號(hào)為HM366546。該基因全長(zhǎng)1367bp，包含一個(gè)957bp的編碼區(qū)共編碼318個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為35.2KD。該基因編碼的氨基酸中含有明顯的DOF區(qū)。PpDOF1與桃基因組預(yù)測(cè)基因ppa009811m同源性最高。結(jié)果說明PpDOF1與ppa09811m可能是同一基因，但是序列

4、存在差異，可能是由于預(yù)測(cè)基因不完全正確造成的。PpDOF1在幼根、莖、葉和花中均有表達(dá)，在幼根和莖中大量表達(dá)，在葉中表達(dá)較弱，在花中的表達(dá)最弱。用5mmoolL-1NO3-處理30分鐘后PpDOF1的表達(dá)明顯上調(diào)，1小時(shí)后表達(dá)水平下降。該結(jié)果說明PpDOF1能對(duì)NO3-1產(chǎn)生響應(yīng)。PpDOF1轉(zhuǎn)基因擬南芥根中全氮含量明顯高于對(duì)照(14％)，而地上部的全氮含量無明顯變化。一些參與氮信號(hào)、吸收和同化的基因，如而R398C、NRT1.8、NR

5、T1.7和NR的編碼基因表達(dá)發(fā)生了變化，說明PpDOF1可能參與調(diào)節(jié)氮代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。PpDOF1轉(zhuǎn)基因擬南芥主花序前10cm內(nèi)的果莢數(shù)約為16，而對(duì)照為12；并且果莢在花序上的分布表現(xiàn)出分布不均勻的特點(diǎn)。通過DGE技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因擬南芥的基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)莖稈和花序發(fā)育的Ovatefamilyprotein(OFP)、KNOTTED1-likehomeobox(KNOX)genes和BEL1-like(BELL)homeodomai

6、nproteins類基因的表達(dá)均發(fā)生了不同程度的變化。轉(zhuǎn)基因擬南芥37個(gè)參與脂類轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的基因的表達(dá)也發(fā)生了變化(其中13個(gè)被上調(diào)，24個(gè)被下調(diào))。
　　 蔗糖非發(fā)酵-1-型相關(guān)蛋白激酶-1(SnRK1)編碼基因能對(duì)根際NO3-信號(hào)產(chǎn)生應(yīng)答，為此對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已獲得的2個(gè)MhSnRK1超表達(dá)番茄株系(T2-7，T2-9)進(jìn)一步進(jìn)行研究，結(jié)果表明：葉片SnRK1活性增加了15％-16％。轉(zhuǎn)基因番茄光系統(tǒng)Ⅰ蛋白PsaF和光系統(tǒng)Ⅱ蛋白P

7、sbR編碼基因的表達(dá)上調(diào)，Rubisco甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因的表達(dá)下調(diào)；葉片的光合速率也有明顯提高。葉片SPS和SS合成方向的活性無明顯變化；相反，SS分解方向的活性明顯上升，T2-7的SS分解方向比野生型上升了36％。AGPase活性增加了45％左右；可溶性糖和淀粉含量都比野生型高，而且葉片中淀粉日變化較野生型劇烈。T2-9葉片和果實(shí)中可溶性糖含量分別增加了30％-40％。轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中AsA和可滴定酸含量均有明顯降低。T2-9果實(shí)中

8、AsA和可滴定酸含量分別下降為野生型的80％和66％。轉(zhuǎn)基因番茄中可溶性蛋白和NR活性明顯降低；15N示蹤的研究表明，氮肥吸收效率升高。
　　 NO3-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NRT)不僅負(fù)責(zé)植物NO3-的運(yùn)輸還能響應(yīng)根際NO3-信號(hào)，有研究表明AtNRT1.1可能是NO3-信號(hào)感受器。根據(jù)GenBank上注冊(cè)的蘋果中NRT的EST序列設(shè)計(jì)特異引物，克隆了三個(gè)平邑甜茶NO3-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白全長(zhǎng)基因，分別命名MhNRT1.5、MhNRT2.1和MhN

9、RT2.5，GenBank注冊(cè)號(hào)分別為FJ437208；FJ168536；FJ168537。這三個(gè)基因分別編碼583、583和504個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為64.75、57.27和54.51KD。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)它們編碼的蛋白都定位在質(zhì)膜上。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究它們的表達(dá)量的變化，結(jié)果表明：三個(gè)基因在平邑甜茶各個(gè)器官均有表達(dá)。根際施用NO3-后三個(gè)基因的表達(dá)都開始增加，除了10mmolL-1NO3-處理的MhNRT1.5和MhNR

10、T2.5在4h后達(dá)到最大值外，其它均在12h達(dá)到最大值。由此可見，MhNRT1.5、MhNRT2.1租MhNRT2.5的表達(dá)受NO3-的誘導(dǎo)。MhNRT1.5和MhNRT2.1轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中NO3-含量均有所上升。通過對(duì)表現(xiàn)型的觀察發(fā)現(xiàn)MhNRT1.5轉(zhuǎn)基因擬南芥主花序的果莢密度也明顯大于對(duì)照。MhNRT1.5轉(zhuǎn)基因擬南芥主花序前10cm內(nèi)的果莢數(shù)約為18，而對(duì)照為12。與PpDOF1轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)型不同的是：果莢分布相對(duì)比較均勻