中國人群先天性巨結(jié)腸癥與RET,NRG1, NRG3基因單核苷酸多態(tài)性的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分:
　　第一部分:中國人群先天性巨結(jié)腸癥RET，NRG1，NRG3基因SNPs位點(diǎn)關(guān)聯(lián)研究及交互作用分析
　　目的：
　　本課題對文獻(xiàn)報(bào)道中GWAS發(fā)現(xiàn)的RET基因上的兩個(gè)SNPs位點(diǎn)，NRG1和NRG3上各三個(gè)SNPs位點(diǎn)與中國人群HSCR發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。探究這八個(gè)位點(diǎn)陽性SNPs所在的基因與基因的聯(lián)合效應(yīng)對HSCR易感性的影響程度。通過以上三個(gè)主要候選基因SNPs與HSCR的相關(guān)性研究，為

2、進(jìn)一步闡明中國人群HSCR發(fā)病的分子學(xué)機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集和全血基因組DNA抽提：根據(jù)國際公認(rèn)的巨結(jié)腸診斷標(biāo)準(zhǔn)（2005年第四屆國際巨結(jié)腸與相關(guān)神經(jīng)嵴源性疾病會議），診斷依據(jù)術(shù)中組織活檢或者術(shù)后病理檢查確診為HSCR的患者為病例組。對照組血液標(biāo)本選擇于同一時(shí)期無消化道和神經(jīng)嵴相關(guān)畸形的患者。本研究經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)，全部患兒及對照組留取的組織及血液標(biāo)本均獲得家長知情同意。

3、基因組DNA抽提采用德國Qiangen公司試劑盒提供的方法抽提，提取后-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　2.SNP的確定和分型：利用出版文獻(xiàn)和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）查找目的基因的多態(tài)性位點(diǎn)。本研究采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例-對照研究，選取RET基因兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，NRG1和NRG3基因多態(tài)性位點(diǎn)各三個(gè)，采用PCR擴(kuò)增目的基因，Taqman基因分型技術(shù)對上述八個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因型

4、檢測。
　　3.RET、NRG1和NRG3基因和HSCR相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：本研究將對上述八個(gè)位點(diǎn)與HSCR發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，以及RET、NRG1和NRG3基因各位點(diǎn)之間聯(lián)合作用對HSCR發(fā)病影響采用非條件Logistic回歸（Logistic regression，LR）的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。SNPs位點(diǎn)與HSCR的相關(guān)性用ORs（比值比，odds ratios，）和95％CIs（可信區(qū)間，confidence intervals，

5、）表示。病例組和對照組人口學(xué)資料中的分類變量（如性別等）和連續(xù)變量（如年齡等）之間的差異分別采用卡方（Chi squared，X2）檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。采用Logistic回歸模型分析不同基因的多個(gè)SNPs聯(lián)合作用以及不同位點(diǎn)基因的累積效應(yīng)與HSCR發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。同一基因上不同SNPs位點(diǎn)之間的連鎖不平衡程度應(yīng)用Haploview4.2軟件進(jìn)行分析。運(yùn)用Hardy-weinberg平衡定律來檢驗(yàn)兩組樣本人群中各SNPs位點(diǎn)基因頻率與

6、基因型頻率是否平衡。所有數(shù)據(jù)P值＜0.05確定為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.本次研究共納入362例HSCR病例和1442例對照。在兩組中男女所占百分比均為75.97%和24.03%，病例組和對照組中年齡平均值分別為1.01（±0.88）歲和1.18（±0.79）歲。性別和年齡分布情況在病例組及對照組中比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　2.在此次病例-對照研究的八個(gè)GWAS發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)中，位于RET基因轉(zhuǎn)錄增

7、強(qiáng)子區(qū)的兩個(gè)SNP位點(diǎn)rs2435357和rs2506030以及位于NRG1基因一號內(nèi)含子區(qū)的兩個(gè)SNP位點(diǎn)rs2439302和rs7835688均與HSCR發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)（P＜0.05）。但是，位于NRG1一號內(nèi)含子區(qū)的位點(diǎn)rs16879552以及NRG3基因一號內(nèi)含子區(qū)的三個(gè)SNP位點(diǎn)rs10748842，rs10883866和rs6584400均與HSCR發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)性（P＞0.05）。除此之外，在純和和雜合突變中也未發(fā)現(xiàn)HSCR

8、與其相關(guān)性。
　　3.對病例組和對照組連鎖不平衡分析顯示：RET基因中rs2435357和rs2506030兩位點(diǎn)間連鎖不平衡r2=0.041，說明兩位點(diǎn)間連鎖不平衡程度較弱；NRG1基因中rs2439302和rs7835688兩位點(diǎn)間連鎖不平衡r2=0.95，說明兩位點(diǎn)間連鎖不平衡程度較強(qiáng)。所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，用rs2439302多態(tài)性位點(diǎn)代表rs7835688多態(tài)性位點(diǎn)對基因-基因之間的累積效應(yīng)進(jìn)行分析。通過軟件分析，在HSCR

9、和對照組兒童中各SNP位點(diǎn)基因頻率與基因型頻率均符合Hardy-weinberg平衡。
　　4.對上述四個(gè)位點(diǎn)的累積效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)rs2506030-GG和rs2439302-GG以及rs2435357TT和rs2439302-GG突變純和位點(diǎn)同時(shí)存在時(shí)，個(gè)體患HSCR風(fēng)險(xiǎn)分別增加25.69倍（95%CI=10.11–65.29，P=9.12E-12）和25.57倍（95%CI=10.88–60.07，P=1.02E-13）；當(dāng)rs

10、2506030-GG，rs2439302-GG和rs2435357-TT三個(gè)突變純和位點(diǎn)位點(diǎn)同時(shí)存在時(shí)，個(gè)體患HSCR風(fēng)險(xiǎn)增加56.63倍（95%CI=12.16–262.83，P=4.50E-07）。同時(shí)，在攜帶有rs7835688-CC和rs2506030-GG，以及rs7835688-CC和rs2435357-TT或者rs7835688-CC，rs2506030-GG和rs2435357-TT純和個(gè)體中，患有HSCR風(fēng)險(xiǎn)分別為OR

11、=24.13（95%CI=9.54–61.05，P=1.80E-11），OR=24.10（95%CI=9.82–59.13，P=3.68E-12），OR=54.83（95%CI=10.94–274.74，P=1.12E-06）。同時(shí)，檢測了上述三個(gè)SNPs位點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)等位基因累及基因效應(yīng)與疾病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。攜帶有四個(gè)以上等位基因位點(diǎn)的個(gè)體患HSCR的風(fēng)險(xiǎn)較高（攜帶有4、5、6個(gè)等位基因的患病風(fēng)險(xiǎn)分別為OR=2.30，P=5.54E-11；O

12、R=4.28，P=2.08E-18；OR=23.43，P=5.11E-13）。而攜帶有小于4個(gè)等位基因則表現(xiàn)出保護(hù)效應(yīng)（攜帶有0、1、2、3個(gè)等位基因的患病風(fēng)險(xiǎn)分別為OR=0.39，P=5.09E-02；OR=0.27，P=3.16E-04；OR=0.33，P=4.32E-10；OR=0.59，P=8.00E-05）。最高患病風(fēng)險(xiǎn)是最低患病風(fēng)險(xiǎn)的86.8倍。
　　結(jié)論：
　　1.RET和NRG1基因是中國HSCR患兒的易感基

13、因；
　　2.在中國人群中首次證實(shí)GWAS中發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)rs2439302與HSCR的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；同時(shí)在中國人群中驗(yàn)證了rs2435357，rs2506030，和rs7835688與HSCR的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；
　　3.HSCR易感基因RET及NRG1上的SNPs互相連鎖?；糎SCR的風(fēng)險(xiǎn)隨著個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)等位基因的增加而不斷升高，呈現(xiàn)出等位基因-劑量（風(fēng)險(xiǎn)等位基因個(gè)數(shù)）效應(yīng)；
　　4.rs2506030，rs2439302，r

14、s2435357和rs7835688在HSCR的遺傳易感性中發(fā)揮著重要的基因-基因交互作用，但其生物學(xué)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。
　　第二部分:RET，NRG1基因單核苷酸多態(tài)性對基因表達(dá)的影響
　　目的：
　　分析RET基因功能性多態(tài)性位點(diǎn)rs2506030和rs2439302，NRG1基因功能性多態(tài)性位點(diǎn)rs2435357和rs7835688對基因表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1.在第一部分中，由于rs243

15、9302和rs7835688存在連鎖不平衡（r2=0.95），所以在此部分用rs2439302多態(tài)性位點(diǎn)功能代表rs7835688多態(tài)性位點(diǎn)功能。在病理結(jié)果證實(shí)的HSCR病人中各選取十例rs2506030，rs2439302和rs2435357野生型，雜合突變型以及純和突變型位點(diǎn)具有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞部分的全層結(jié)腸組織。提取組織蛋白及總RNA。運(yùn)用real-time PCR和western blot方法檢測組織中RET基因和NRG1基因的mRN

16、A轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　2.免疫組化：分別選取相應(yīng)患兒擴(kuò)張段腸管組織切片，觀察腸管中神經(jīng)元，確定含有神經(jīng)元石蠟塊，分別行RET及NRG1免疫組化染色，觀察腸管組織切片鏡下上述兩種基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　與rs2435357-CC或rs2506030-AA相比，RET基因mRNA，蛋白表達(dá)水平以及免疫組化染色顯示在rs2435357-CT和rs2435357-TT或者rs2506030-AG和rs25060