基因工程菌株Yarrowia lipolytica 30利用菊芋提取液產(chǎn)檸檬酸的研究.pdf

1、目前檸檬酸的生產(chǎn)主要以富含蔗糖、葡萄糖的原料通過黑曲霉(Aspergillus niger)的深層發(fā)酵方式獲得，但該菌種容易產(chǎn)生大量的固液廢物，并且不利于遺傳改造。近些年來，Yarrowia lipolytica已被考慮作為檸檬酸生產(chǎn)的潛在菌種成為研究的熱點(diǎn)。從經(jīng)濟(jì)角度而言，通過基因工程對Y. lipolytica進(jìn)行遺傳改造對提高檸檬酸產(chǎn)量具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室已通過基因手段獲得了一株具有菊粉酶活力并敲除ACL1基因且超表達(dá)ICL1基

2、因的基因工程菌株Y. lipolytica30，該菌株利用100.0g/l菊粉在發(fā)酵罐中一步發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸，產(chǎn)酸量可達(dá)84.0g/l。為了進(jìn)一步節(jié)約發(fā)酵成本，我們考慮以菊芋提取液作為基因工程菌株Y. lipolytica30的檸檬酸發(fā)酵底物。
　　采用單因素實(shí)驗(yàn)對菊芋中糖分的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的處理?xiàng)l件：料液比1:20，提取時(shí)間50 min，提取溫度100℃，HCl濃度0.05M，提取次數(shù)4次。將所得的菊芋提取液經(jīng)Ca(O

3、H)2處理并進(jìn)行初步的檸檬酸產(chǎn)量測試，其產(chǎn)酸量為24.3g/l，檸檬酸產(chǎn)率為0.39（g per g TS），而菊芋粗提液產(chǎn)酸量僅為8.21g/l，檸檬酸產(chǎn)率為0.17（g per g TS），說明基因工程菌株Y. lipolytica30利用經(jīng)過Ca(OH)2處理的菊芋提取液產(chǎn)檸檬酸能力明顯提升。
　　通過搖瓶實(shí)驗(yàn)對基因工程菌株Y. lipolytica30利用菊芋提取液進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵的產(chǎn)酸條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以菊芋提取

4、液為底物產(chǎn)檸檬酸不需要添加額外的(NH4)2SO4、KH2PO4、VB1和Mg2+，菊芋提取液作為底物的最適總糖濃度為80.0g/l，最適接種量為106cells/50ml。同時(shí)我們在10-l發(fā)酵罐基礎(chǔ)上對基因工程菌株Y. lipolytica30以菊粉底物發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最適發(fā)酵條件：通氣量5 l/min/l，轉(zhuǎn)速300rpm，溫度28℃，初始pH6。最后，基因工程菌株Y. lipolytica30在10-l發(fā)酵發(fā)酵罐中

5、利用菊芋提取液為發(fā)酵底物，在上述最適條件下，發(fā)酵336 h后，發(fā)酵液中的菌體含量達(dá)到7.7 g/l，檸檬酸產(chǎn)量最終達(dá)到68.3g/l，殘余總糖為9.16g/l，還原糖殘留量為2.14 g/l，88.5％的總糖被用于合成檸檬酸和細(xì)胞生長。
　　最后利用鈣鹽法從檸檬酸發(fā)酵液中提取得到檸檬酸，經(jīng)過反復(fù)純化后得到檸檬酸晶體。利用高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography HPLC)分析，與檸