產(chǎn)漆酶木霉ZF-2分離、發(fā)酵與初步應用研究.pdf

1、漆酶（Laccase）是一種含銅的多酚氧化酶，具有廣泛的底物，不僅能催化氧化多種芳香族化合物，還能降解木質素、去除許多有毒酚類物質如苯氧基類除草劑等的毒性，還可以使多種染料脫色及去除工業(yè)廢水的毒性。近年來在造紙、環(huán)保、食品、醫(yī)藥衛(wèi)生、生物檢測等領域有了較廣泛的應用，因此對漆酶的研究具有重要的理論和現(xiàn)實意義。
　　 本研究利用愈創(chuàng)木酚平板篩選法，從山東省各地采集的朽木和土壤樣品中分離得到一株產(chǎn)漆酶活力較高的真菌（菌株編號ZF-2）

2、。本研究對該菌株進行了鑒定，利用響應面法對搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，利用粗酶液對活性艷藍KN-R、結晶紫和剛果紅進行脫色降解，并初步探討氧化還原介質的添加和脫色條件對脫色效果的影響，主要研究結果如下：
　　 1.ZF-2菌株的鑒定通過菌體培養(yǎng)特征、形態(tài)學特征觀察、5.8S rRNA序列測定及其系統(tǒng)進化樹分析，鑒定ZF-2菌株為哈茨木霉（Trichoderma harzianum），該菌株的5.8S rRNA序列已

3、在GeneBank上注冊，登錄號為HM051191。
　　 2.ZF-2 產(chǎn)漆酶的發(fā)酵培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件優(yōu)化首先通過單因素篩選，確定了最佳碳源為麥草粉、最佳氮源為(NH4)2SO4和豆粕、最佳金屬離子為Cu2+、最佳誘導劑為吐溫-20，然后利用正交試驗確定最佳C/N 比。在此基礎上，通過響應面法對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，首先運用Plackett-Burman（PB）試驗分析篩選出的各個培養(yǎng)基組分，以獲得顯著影響因子，然后通過最陡爬

4、坡法接近最大響應區(qū)域，最后采用中心組合試驗和響應面分析確定主要影響因子的最佳濃度。
　　 由上述方法確定ZF-2 產(chǎn)漆酶發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方為：麥草粉7.6 g/L、豆粕23g/L、(NH4)2SO4 1 g/L、CuSO4 0.51 g/L、吐溫-20 1 g/L、MgSO4 1 g/L、KH2PO4 0.6 g/L。
　　 最佳發(fā)酵條件為：接種量2 ％、發(fā)酵時間42 h、發(fā)酵溫度28 ℃、裝液量50 mL/250mL

5、、轉速150 rpm，自然pH。
　　 運用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行搖瓶發(fā)酵，漆酶酶活達到72.549 U/mL，較基礎發(fā)酵培養(yǎng)基漆酶活性提高56.33倍。
　　 3.ZF-2 漆酶對染料的脫色降解初步探究了ZF-2 漆酶在偶氮染料、蒽醌染料和三苯甲烷類染料脫色中的作用。用漆酶直接處理偶氮染料剛果紅，反應5 h 脫色率達到65.66 ％，直接處理蒽醌染料活性艷藍KN-R和三苯甲烷類染料結晶紫4 h，脫色率分別達到

6、80.09 ％和26.09 ％。漆酶協(xié)同氧化還原介質（8-羥基喹啉、紫脲酸銨、L-羥基苯并三唑（HBT））對三種染料進行脫色降解，結果表明,8-羥基喹啉和紫脲酸銨對三種染料的脫色率無顯著作用，而添加HBT后，三種染料的脫色率均明顯提高，活性艷藍KN-R和結晶紫與漆酶/HBT 反應4 h后，脫色率分別提高到92.87％和71.32％；剛果紅與漆酶/HBT 反應2 h后，脫色率提高到79.03％。
　　 對三種染料脫色條件的初步研究