離體大鼠表皮干細(xì)胞熱損傷模型制作的研究.pdf

1、第一部分：分離鑒定SD鼠表皮干細(xì)胞
　　目的：對SD大鼠表皮干細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，并對所培養(yǎng)表皮干細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測，以確保所培養(yǎng)的細(xì)胞群為富集了表皮干細(xì)胞的細(xì)胞群。
　　方法：利用胰酶消化法分離大鼠表皮干細(xì)胞，Ⅳ型膠原差速貼壁法進(jìn)行篩選，克隆實(shí)驗(yàn)來鑒定細(xì)胞增殖能力，免疫熒光共染角蛋白19及β1整合素，聯(lián)合陰性標(biāo)記物角蛋白10，進(jìn)行表型鑒定。
　　結(jié)果：倒置相差顯微鏡所得細(xì)胞形態(tài)多呈類圓形、體積小、核大，增

2、殖后期可見馬路石樣結(jié)構(gòu)。熒光檢測結(jié)果表明所細(xì)胞β1整合素及角蛋白19共表達(dá)，陰性標(biāo)記物角蛋白10無明顯表達(dá)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)顯示所分離的細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖能力。
　　結(jié)論：成功建立了獲得表皮干細(xì)胞體外分離的方法
　　第二部分：SD鼠離體表皮干細(xì)胞熱損傷模型建立
　　目的：體外建立SD鼠ESCs熱損傷模型，研究皮膚燒傷后ESCs生物學(xué)變化。
　　方法：體外培養(yǎng)大鼠表皮干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在水浴鍋中分別以51、52、53、5

3、4℃孵育30s，對照組細(xì)胞37℃孵育30s，每組重復(fù)3次。用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞存活率進(jìn)行定量分析，熱損傷后干細(xì)胞內(nèi) HSP70蛋白表達(dá)量的變化通過免疫印跡試驗(yàn)檢測，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測HSP70 mRNA的變化。
　　結(jié)果：隨著熱損傷溫度的升高，表皮干細(xì)胞中凋亡和死亡細(xì)胞逐漸增加，細(xì)胞存活率逐漸下降；52℃時(shí)表皮干細(xì)胞存活率為85.2％，53℃時(shí)為83.7%，54℃存活率為53.2%。Western blot檢測結(jié)果顯示隨溫

4、度升高HSP70表達(dá)量升高，53℃達(dá)到高峰，54℃時(shí)表達(dá)量開始下降當(dāng)仍比對照組高。RTqPCR檢測結(jié)果顯示HSP70mRNA表達(dá)量在一定范圍內(nèi)隨溫度升高而增加，以53℃的HSP70mRNA表達(dá)量最為顯著（P<0.05），而在54℃，55℃時(shí)表達(dá)量急劇下降并且與對照組相比顯著降低。
　　結(jié)論：熱損傷能造成離體大鼠表皮干細(xì)胞凋亡，HSP70表達(dá)量在一定溫度范圍內(nèi)增高并為細(xì)胞提供保護(hù)作用，53℃孵育30s為構(gòu)建表皮干細(xì)胞熱損傷模型的較好