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文檔簡介
1、本文分三個部分進(jìn)行探討。
第一部分:小鼠卵巢早衰模型的建立
目的:建立小鼠卵巢早衰(Premature ovarian failure, POF)動物模型,為探討線粒體融合蛋白2(mitofusion2,Mfn2)與卵巢早衰相關(guān)性提供基礎(chǔ)。
方法:40只清潔級雌性昆明小鼠,分為處理組(腹腔注射順鉑1.5mg/kg體重,連續(xù)10天)、對照組(腹腔注射無菌生理鹽水,連續(xù)10天),每組20只。一月后剖取小鼠卵巢和
2、心臟取血,觀察小鼠卵巢重量及形態(tài)學(xué)、各級卵泡數(shù)的變化及性激素(雌二醇Estradiol,E2和卵泡刺激素Follicle stimulating hormone,F(xiàn)SH)水平。
結(jié)果:順鉑可引起小鼠體重明顯下降,動情周期紊亂,卵巢重量明顯減輕,卵巢間質(zhì)增生,竇前及竇狀卵泡敷減少明顯,與對照組相比具有明顯差異。血清中雌激素水平較對照組降低,卵泡刺激素水平與對照組相比明顯增高。
結(jié)論:采用腹腔注射順鉑連續(xù)注射10d的方案
3、建模,小鼠卵巢功能明顯衰退,卵巢組織學(xué)及內(nèi)分泌改變與臨床卵巢早衰患者相似,表明建模成功。
第二部分:Mfn2在卵巢早衰模型中的表達(dá)研究
目的:研究Mfn2在卵巢早衰模型中的表達(dá)情況,初步確定Mfn2與卵巢早衰的相關(guān)性。
方法:免疫組化觀察Mfn2在卵巢組織中的表達(dá)定位和半定量;采用蛋白印記(Western Blot)檢測對照組與處理組(即POF組)卵巢組織中Mfn2的蛋白表達(dá)情況;RT-PCR觀察Mfn2
4、mRNA在對照組與處理組中的表達(dá)。
結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示Mfn2定位于細(xì)胞胞漿,Mfn2的表達(dá)在處理組比對照組明顯降低(P<0.01);Mfn2蛋白在處理組卵巢組織中的相對表達(dá)低于對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;實(shí)時熒光定量PCR顯示處理組Mfn2 mRNA的相對表達(dá)量顯著低于對照組(P<0.01)。
結(jié)論:與對照組相比,運(yùn)用上述三種檢測方法均顯示處理組卵巢組織中Mfn2的表達(dá)量明顯降低,提示卵巢早衰與Mfn2的表達(dá)具
5、有一定相關(guān)性。
第三部分:Mfn2與卵巢早衰發(fā)病機(jī)制相關(guān)性的探討
目的:通過檢測對照組及處理組卵巢組織中三磷酸腺苷(adenosine5’-triphosphate,ATP)含量和線粒體膜電勢,以及觀察卵巢組織中細(xì)胞超微結(jié)構(gòu);檢測兩組卵巢內(nèi)細(xì)胞的凋亡情況和凋亡相關(guān)蛋白Bcell lymphoma-2(Bcl-2)和Bcl-2 Associated X Protein(Bax)的表達(dá),探討Mfn2在卵巢早衰組織中對線粒
6、體代謝及形態(tài)以及細(xì)胞凋亡的影響,從而揭示Mfn2在卵巢早衰中的可能作用機(jī)制。方法利用磷鉬酸比色法檢測2組卵巢組織中ATP含量。JC-1法檢測兩組卵巢組織中線粒體膜電勢的變化。透射電鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)檢測3例對照組及6例處理組卵巢組織中細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。Tunel法檢測對照組與處理組卵巢組織中細(xì)胞凋亡情況。Western Blot法檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)情況。
7、結(jié)果:處理組卵巢組織中ATP含量明顯低于對照組(P<0.05),且線粒體膜電勢結(jié)果顯示處理組明顯低于對照組。對照組卵巢組織中細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)規(guī)則,輪廓光滑完整,線粒體嵴排列基本規(guī)則;處理組卵巢組織中細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)與對照組相差不大,但細(xì)胞內(nèi)有大量脂肪堆積,細(xì)胞間距增大,膠原纖維的出現(xiàn)意味著卵巢的纖維化,與對照組卵巢組織相比,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張不明顯。TUNEL法檢測結(jié)果顯示卵巢組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)處理組明顯高于對照組(P<0.05)。而處理組卵巢
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