線粒體融合蛋白2在卵巢功能不全中的表達(dá)及與其發(fā)病相關(guān)性探討.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述:
　　第一部分:Mfn2在卵巢功能不全中的表達(dá)研究
　　目的:研究人線粒體融合基因2（Mitofusin2，Mfn2）在卵巢功能不全中的表達(dá)水平，對(duì)Mfn2與卵巢功能不全發(fā)病關(guān)聯(lián)性作一初步探索。
　　方法:采集接受體外受精-胚胎移植（IVF-ET）患者的卵泡液，分兩組：卵巢功能正常組（即Normal group）與卵巢功能不全組（即POI group）。依據(jù)連續(xù)密度梯度分層的基本原理，使

2、用percoll分離提純顆粒細(xì)胞；免疫印跡方法（Western Blot）用以檢測兩組顆粒細(xì)胞中Mfn2蛋白的表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）用以檢測兩組顆粒細(xì)胞中Mfn2 mRNA的表達(dá)；FITC熒光標(biāo)記的Annexin V以及PI染料染色后兩組顆粒細(xì)胞的凋亡評(píng)估采用熒光顯微鏡進(jìn)行。
　　結(jié)果:與Normal組相比，

3、POI組Mfn2蛋白和Mfn2 mRNA表達(dá)水平均下降，顆粒細(xì)胞凋亡增多。
　　結(jié)論:卵巢功能不全與顆粒細(xì)胞內(nèi)Mfn2的表達(dá)水平具有一定相關(guān)性；Mfn2低表達(dá)可能通過影響顆粒細(xì)胞的凋亡參與卵巢功能不全的發(fā)生。
　　第二部分:Mfn2基因干擾序列及最佳轉(zhuǎn)染濃度的篩選
　　目的:使用Mfn2小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）對(duì)人顆粒細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后優(yōu)選最佳濃度和高效沉默序列。
　　方

4、法:以人Mfn2 mRNA序列作為模板設(shè)計(jì)并化學(xué)合成1對(duì)Cy3-siRNA作為對(duì)照序列，3對(duì)Mfn2-siRNA作為沉默序列。以人卵泡液顆粒細(xì)胞作為靶細(xì)胞采用不同濃度Cy3-siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分5組：0 nM組、20 nM組、30 nM組、50 nM組和100 nM組，熒光顯微鏡觀察不同濃度轉(zhuǎn)染后顆粒細(xì)胞熒光強(qiáng)度差異，優(yōu)選轉(zhuǎn)染的最佳濃度；利用脂質(zhì)體2000（Lipofectamine2000，lip2000）的媒介作用，選擇優(yōu)選濃

5、度轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分6組：Blank group（未加lip2000）、Regent group（單加lip2000）、Cy3-siRNA group（轉(zhuǎn)染lip2000+Cy3-siRNA序列）、Mfn2-siRNA1 group（轉(zhuǎn)染lip2000+Mfn2-siRNA序列1）、Mfn2-siRNA2 group（轉(zhuǎn)染lip2000+Mfn2-siRNA序列2）、Mfn2-siRNA3 group（轉(zhuǎn)染lip2000+Mfn2-s

6、iRNA序列3），運(yùn)用Western Blot技術(shù)和qRT-PCR技術(shù)檢測各組Mfn2蛋白和mRNA的表達(dá)水平，篩選出沉默效果最好的轉(zhuǎn)染序列。
　　結(jié)果:以不同濃度的Cy3-siRNA轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞后，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)50nM和100nM轉(zhuǎn)染濃度時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。qRT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示不同Mfn2-siRNA序列轉(zhuǎn)染后Mfn2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均下降，其中Mfn2-siRNA序列3下降最為顯著。

7、>　　結(jié)論:基于經(jīng)濟(jì)有效原則，在達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求轉(zhuǎn)染效率的基礎(chǔ)上，選擇50nM作為轉(zhuǎn)染人卵泡液顆粒細(xì)胞的優(yōu)選濃度。Mfn2-siRNA序列3轉(zhuǎn)染細(xì)胞后Mfn2表達(dá)水平最低，說明沉默效果最佳，因此確定其為最佳轉(zhuǎn)染序列。
　　第三部分:Mfn2與卵巢功能不全發(fā)病相關(guān)性探討
　　目的:觀察顆粒細(xì)胞中Mfn2沉默后表達(dá)水平差異對(duì)線粒體代謝、凋亡相關(guān)基因表達(dá)及顆粒細(xì)胞凋亡的影響，揭示Mfn2在卵巢功能不全中的可能作用機(jī)制。
　　方法

8、:收集卵巢功能正?；颊呗雅菀海捎妹芏忍荻入x心法分離純化的顆粒細(xì)胞作為靶細(xì)胞，以lip2000為介質(zhì)，分別使用Mfn2基因沉默最優(yōu)序列（Mfn2-siRNA3）和對(duì)照序列（Cy3-siRNA）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分兩組：對(duì)照組（Cy3-siRNA group）和沉默組（Mfn2-siRNA group）。運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)分別檢測Mfn2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，明確沉默有效；分別采用熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)

9、胞技術(shù)檢測兩組顆粒細(xì)胞中線粒體膜電位和顆粒細(xì)胞凋亡情況；凋亡相關(guān)蛋白CytC、Caspases9、Caspases3、Bax、Bcl2的表達(dá)運(yùn)用Western Blot技術(shù)進(jìn)行檢測，以明確顆粒細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:與對(duì)照組相比，沉默組Mfn2mRNA和蛋白表達(dá)水平降低；線粒體膜電位下降，顆粒細(xì)胞凋亡增加；凋亡相關(guān)蛋白CytC、Caspases9、Caspases3、Bax表達(dá)水平均增加，Bcl2表達(dá)水平降低。