C10ORF2，HELQ和PRIM1基因在原發(fā)性卵巢功能不全中的作用和相關機制研究.pdf

1、本文分以下幾個章節(jié)進行探討：
　　第一章 線粒體相關基因C10ORF2在家族性原發(fā)性卵巢功能不全合并感音神經(jīng)性耳聾(Perrault綜合征)發(fā)病中的作用和機制研究
　　第一節(jié) Perrault綜合征家系全外顯子組測序研究
　　目的:原發(fā)性卵巢功能不全(POI)是一種高度異質(zhì)性、病因復雜的婦科內(nèi)分泌疾病，患者通常在40歲以前就出現(xiàn)閉經(jīng)，發(fā)病率約為1％。該疾病的特點是原發(fā)性或繼發(fā)性閉經(jīng)并且伴隨不同程度的低雌激素癥狀。目前尚

2、沒有可靠的早期診斷指標，也不能早期有效的預防該疾病的發(fā)生和進展，因而病因研究和早期識別高風險人群是十分重要的。原發(fā)性卵巢功能不全主要分為綜合征型POI和非綜合征型POI兩種，并在兩種類型中分別篩選出了多個致病基因。其中已發(fā)現(xiàn)的綜合征型POI包括脆X綜合征、小瞼裂綜合征(BPES)、半乳糖血癥、碳水化合物缺乏糖蛋白綜合征Ⅰ型、Perrault綜合征(PS)等，通過全外顯子組測序發(fā)現(xiàn)Perrault綜合征患者的致病基因包括HARS2、LAR

3、S2、C10ORF2、CLPP等。Perrault綜合征患者在患有感音神經(jīng)性耳聾的同時，女性患者還伴有典型的原發(fā)性卵巢功能不全癥狀。我們對先證者及家系其他成員進行全外顯子組測序，以期發(fā)現(xiàn)新的POI致病基因。
　　方法:對該Perrault綜合征中先證者、患病姐妹以及父母采用AgilentSureSelect Human All Exon.V5技術對全外顯子組進行測序，將檢出的全部單堿基改變、插入/缺失與公共數(shù)據(jù)庫比對排除已知多態(tài)，

4、之后檢出造成氨基酸改變的非同義突變，再根據(jù)孟德爾遺傳定律篩出候選位點。最后按照常染色體隱性遺傳的方式進行基因篩選，且在患者中篩選出共同的純合突變位點。
　　結(jié)果:全外顯子組測序后發(fā)現(xiàn)了符合常染色體隱性遺傳的一個錯義突變位點，該突變位于C10ORF2基因的c.1388G＞A(p.R463 Q)位點，屬于一個新發(fā)的錯義突變，該突變使該位置的氨基酸由精氨酸變?yōu)楣劝滨０?。患者為純合突變，并發(fā)生于編碼蛋白的解旋酶區(qū)域。C10ORF2基因的解

5、旋酶作用對線粒體的復制至關重要，推測該突變導致的蛋白功能改變影響了細胞線粒體功能，從而導致了Perrault綜合征的發(fā)生。
　　結(jié)論:通過外顯子測序技術在C10ORF2基因的解旋區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了新發(fā)錯義突變位點，該基因突變的發(fā)現(xiàn)為從線粒體功能方面探索POI的機制研究提供了新的方向。
　　第二節(jié) C10ORF2基因在原發(fā)性卵巢功能不全中的作用機制研究
　　目的:在原發(fā)性卵巢功能不全伴隨感音神經(jīng)性耳聾患者(PS)家系中，我們通

6、過全外顯子組測序發(fā)現(xiàn)了位于C10ORF2基因上的錯義突變位點c.1388G＞A(p.R463Q)。在既往研究中，發(fā)現(xiàn)位于同一位點的其他氨基酸改變導致患者嬰兒脊髓小腦發(fā)育不全的嚴重表現(xiàn)。C10ORF2基因編碼的DNA解旋酶參與了真核細胞內(nèi)線粒體復制過程，而線粒體作為顆粒細胞和卵母細胞內(nèi)含量豐富的細胞器，調(diào)節(jié)了顆粒細胞和卵母細胞的代謝、細胞周期和細胞信號轉(zhuǎn)導。但目前該基因功能與卵巢的關系尚無報道。本課題通過研究C10ORF2突變導致細胞線粒

7、體功能發(fā)生的變化，探討C10ORF2基因突變引發(fā)POI的致病機制。
　　方法:通過收集Perrault綜合征患者家系外周血，提取先證者外周血液DNA，建立C10ORF2基因c.1388G＞A(p.R463Q)位點突變的永生化淋巴細胞系，檢測患者外周血永生細胞內(nèi)線粒體ATP產(chǎn)生，線粒體拷貝數(shù)以及細胞內(nèi)ROS的生成等，研究C10ORF2基因突變導致的細胞線粒體功能變化。
　　結(jié)果:通過提取患者外周血并構(gòu)建永生化淋巴細胞進行功能實

8、驗，我們發(fā)現(xiàn)C10ORF2基因突變導致了細胞內(nèi)ATP產(chǎn)生減少，ROS水平升高，并發(fā)現(xiàn)C10ORF2基因突變的永生化淋巴細胞內(nèi)線粒體拷貝數(shù)也明顯低于正常入水平。這些實驗結(jié)果表明該基因突變嚴重影響了細胞內(nèi)線粒體的活力和氧化磷酸化水平，導致了線粒體功能障礙。
　　結(jié)論:在C10ORF2基因中，c.1388G＞A(p.R463 Q)位點突變嚴重影響了細胞的線粒體功能。如果該突變發(fā)生在卵巢內(nèi)，將阻礙卵巢內(nèi)卵母細胞和顆粒細胞的正常能量代謝，使

9、卵母細胞成熟障礙。如果線粒體功能嚴重缺陷，使細胞ATP生成減少及ROS累積增多，將導致卵母細胞無法代償而發(fā)生死亡。因此，C10ORF2基因突變導致的卵巢內(nèi)線粒體內(nèi)能量代謝障礙可能是導致POI的重要機制之一。
　　第二章 HELQ基因在原發(fā)性卵巢功能不全患者中的突變分析
　　目的:本研究旨在通過對漢族POI患者進行HELQ基因的外顯子測序，明確該基因在POI患者中的突變情況，為POI病因?qū)W研究及臨床遺傳咨詢與生育指導提供理論依

10、據(jù)。
　　方法:選取在2012至2014年就診于山東大學附屬生殖醫(yī)院的中國漢族POI患者192例，將其血液DNA提取后，進行HELQ基因全部外顯子及外顯子與內(nèi)含子鄰接部位測序。所測結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中國漢族北方正常人群進行序列比對，用SPSS軟件將SNP位點的基因型和等位基因頻率進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:在HELQ基因外顯子測序中發(fā)現(xiàn)6個單核苷酸多態(tài)位點，其中rs1494961，rs2047210兩個位點經(jīng)過統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，基因型

11、和等位基因頻率與對照組相比沒有統(tǒng)計學差異，rs13141136，rs7665103，rs11099600，rs12645412與對照人群比較有統(tǒng)計學差異，但屬于同義改變。
　　結(jié)論:首次在中國漢族原發(fā)性卵巢功能不全患者中篩查了HELQ基因的編碼序列，發(fā)現(xiàn)HELQ基因突變不是原發(fā)性卵巢功能不全的常見原因。
　　第三章 PRIM1基因在原發(fā)性卵巢功能不全患者中的突變分析及基因敲除小鼠研究
　　第一節(jié) PRIM1基因在原發(fā)性

12、卵巢功能不全患者中的突變分析
　　目的:近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性卵巢功能不全和早絕經(jīng)之間具有共同的遺傳易感性，為探索POI的致病機制提供了一個新的方向。有研究通過全基因組關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了13個與絕經(jīng)年齡相關的位點，其中包括PRIM1基因。PRIM基因不僅與自然絕經(jīng)年齡密切相關，并且后續(xù)在歐洲人群中的研究發(fā)現(xiàn)PRIM1基因的非同義多態(tài)性位點rs2277339與早絕經(jīng)和POI也有顯著相關性。PRIM1基因編碼的DNA引發(fā)酶主要參

13、與DNA復制過程，在合成岡崎片段時通過促進合成RNA引物來完成DNA的合成。本研究旨在通過對192例中國漢族POI患者進行PRIM1編碼序列測定，從而確定該基因突變是否導致POI的發(fā)生。
　　方法:選取2014年至2015年就診于山東大學附屬生殖醫(yī)院的192例POI病人為研究對象，應用直接測序技術進行PRIM1基因編碼區(qū)域測序即基因突變篩查，所獲結(jié)果與Ensemble數(shù)據(jù)庫中正常中國北方人群作為對照組進行對比，用SPSS軟件將SN

14、P位點的基因型和等位基因頻率進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:在POI病人中篩查出3個已知SNP位點rs2277339，rs1131514和rs1026565，分別位于外顯子1，外顯子10和內(nèi)含子6中，它們的基因型和等位基因頻率在POI和對照組數(shù)據(jù)中相比沒有統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論:PRIM1基因突變在中國漢族原發(fā)性卵巢功能不全患者中并不常見。雖然在歐洲人群中rs2277339位點與原發(fā)性卵巢功能不全相關，但在中國漢族POI婦女中并無

15、意義，可能由種族差異性或本研究的樣本量較少導致。PRIM1基因在POI發(fā)病中的作用尚需繼續(xù)深入研究。
　　第二節(jié) Prim1基因敲除小鼠的生育力分析
　　目的:在原發(fā)性卵巢功能不全的遺傳學研究中不僅需要基因組學的研究為尋找新的致病位點提供依據(jù)，而探索POI致病機制過程中更需要動物體內(nèi)實驗的生物學支持。因此，在進行PRIM1基因篩查的同時，為了評估PRIM1基因在體內(nèi)的生理作用，我們構(gòu)建了Prim1基因敲除小鼠，研究該基因的缺

16、失是否影響小鼠生長發(fā)育及生殖功能。
　　方法:采用CRISPR/Cas9技術，在該靶基因內(nèi)尋找Cas9切點，設計、構(gòu)建對應的gRNA序列，測試其核酸內(nèi)切活性后，與Cas9 mRNA共同注射小鼠單細胞胚，繁育后取得F1代雜合子Prim1+/-小鼠。通過合籠后記錄生育子代數(shù)，子代基因型比例，卵巢形態(tài)，大小和卵巢內(nèi)各級卵泡數(shù)目等研究Prim1基因缺失對小鼠生殖系統(tǒng)的影響。
　　結(jié)果:Prim1+/-小鼠合籠后沒有純合子Prim1-