小麥TaRCR1和TaAGC1基因在防御紋枯病反應(yīng)中的功能與作用機(jī)制研究.pdf

1、近年來(lái)，由于氣候變暖、耕作制度和種植密度的改變，由禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）引起的小麥紋枯?。╳heat sharp eyespot），已發(fā)展為我國(guó)主要的病害，連續(xù)十多年發(fā)病面積超過(guò)一億畝，損失嚴(yán)重。生產(chǎn)上抗紋枯病小麥品種匱乏，因此分離克隆抗紋枯病相關(guān)基因，研究其功能和作用機(jī)制，為抗紋枯病小麥育種提供基因和理論支撐，具有重要意義。NB-LRR類(lèi)蛋白和蛋白激酶是植物抗病反應(yīng)中兩種重要的蛋白。本研究主要以紋枯病誘

2、導(dǎo)的一個(gè)小麥NB-LRR類(lèi)蛋白編碼基因TaRCR1和一個(gè)蛋白激酶基因TaAGC1過(guò)表達(dá)的小麥和沉默表達(dá)的小麥為實(shí)驗(yàn)材料，研究了這兩個(gè)基因在小麥抗紋枯病反應(yīng)中功能和作用機(jī)制。
　　TaRCR1編碼NB-LRR類(lèi)蛋白，參與小麥對(duì)紋枯病菌的防御反應(yīng)。本研究繼續(xù)對(duì)TaRCR1基因的分子生物學(xué)特性、抗病功能和作用機(jī)制進(jìn)行了研究，主要結(jié)果如下：
　?。?）TaRCR1受紋枯菌誘導(dǎo)表達(dá)，在接種紋枯菌7天后達(dá)到表達(dá)高峰，并且在根和莖中的表達(dá)

3、量高于葉和穗中的表達(dá)量。
　?。?）利用PEG介導(dǎo)GFP-TaRCR1融合蛋白在小麥原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá),進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示TaRCR1分布于小麥的胞質(zhì)和細(xì)胞核中。
　?。?）利用PCR、qRT-PCR和Western blot技術(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)TaRCR1基因小麥T2-T4代植株進(jìn)行轉(zhuǎn)基因分子特征分析，結(jié)果表明，在6個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥株系中轉(zhuǎn)入的TaRCR1能夠遺傳、轉(zhuǎn)錄和過(guò)量表達(dá)；對(duì)TaRCR1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小麥株系和未轉(zhuǎn)基因小

4、麥揚(yáng)麥16（受體）接種紋枯菌進(jìn)行抗病性鑒定，結(jié)果表明TaRCR1基因的過(guò)表達(dá)提高了小麥對(duì)紋枯病的抗性。
　?。?）應(yīng)用大麥條紋花葉病毒（barley stripe mosaic virus,BSMV）誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技術(shù)，摩擦接種BSMV:TaRCR1病毒，以沉默抗紋枯病小麥CI12633中TaRCR1基因的表達(dá)，再接種紋枯病菌進(jìn)行抗病程度分析，結(jié)果說(shuō)明TaRCR

5、1基因表達(dá)量的降低，減弱了寄主小麥對(duì)紋枯病的抗性。
　?。?）利用qRT-PCR分析14個(gè)防御相關(guān)基因在TaRCR1基因過(guò)表達(dá)小麥和受體揚(yáng)麥16以及TaRCR1基因表達(dá)沉默和對(duì)照小麥植株中的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明TaRCR1正向調(diào)控PR1、PR2、chitinase2和TaPIE1的表達(dá)水平，這四個(gè)防御相關(guān)基因的表達(dá)還受紋枯菌的誘導(dǎo)。
　?。?）H2O2和茉莉酸（jasmonic,JA）處理誘導(dǎo)TaRCR1基因的表達(dá)水平，且H2

6、O2預(yù)處理可以提高紋枯菌侵染對(duì)TaRCR1基因的誘導(dǎo)表達(dá)水平；TaRCR1所調(diào)控的PR1、PR2、chitinase2和TaPIE1基因也受H2O2的誘導(dǎo)表達(dá)。
　?。?）接種紋枯菌12 h后，TaRCR1正向調(diào)控CAT1、POX2等活性氧（reactive oxygen species,ROS）清除相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)以及過(guò)氧化物酶（peroxidase,POD）的活性，負(fù)向調(diào)控ROS合成關(guān)鍵基因NOX的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；DAB和NBT染

7、色結(jié)果顯示，TaRCR1基因過(guò)量表達(dá)減弱了紋枯菌侵染引起的ROS積累；對(duì)轉(zhuǎn)TaRCR1基因小麥噴施POD合成的抑制劑NaN3降低了TaRCR1過(guò)表達(dá)植株對(duì)紋枯病的抗性，說(shuō)明小麥體內(nèi)ROS的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于TaRCR1介導(dǎo)的紋枯病抗性非常重要，TaRCR1通過(guò)調(diào)控ROS相關(guān)基因的表達(dá)維持ROS的動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而正向調(diào)控小麥對(duì)紋枯病的抗性反應(yīng)。
　?。?）利用Anti-c-Myc Agarose純化TaRCR1過(guò)表達(dá)小麥體內(nèi)總蛋白，用胰蛋白

8、酶進(jìn)行酶解處理后進(jìn)行質(zhì)譜分析，篩選到一個(gè)TaRCR1互作蛋白TaPP2Ac，酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證明TaRCR1與TaPP2Ac相互作用；BSMV-VIGS實(shí)驗(yàn)證明，TaPP2Ac的表達(dá)沉默提高了小麥對(duì)紋枯病的抗性；同時(shí)，TaPP2Ac的qRT-PCR分析結(jié)果顯示，TaPP2Ac在TaRCR1過(guò)表達(dá)小麥中的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于受體小麥，而在TaRCR1基因表達(dá)沉默小麥植株中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照植株中，推測(cè)TaRCR1通過(guò)負(fù)調(diào)控TaPP2Ac基因

9、的表達(dá)水平提高小麥對(duì)紋枯病的抗性。
　　本課題組前期研究表明，一個(gè)小麥蛋白激酶基因TaAGC1的過(guò)量表達(dá)可以顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)紋枯病的抗性反應(yīng)，而該基因的表達(dá)沉默削弱了小麥對(duì)紋枯病的抗性。
　　本文對(duì)TaAGC1抗紋枯病作用的機(jī)制進(jìn)行了研究，取得以下結(jié)果：
　?。?）TaAGC1響應(yīng)H2O2的脅迫，H2O2處理后TaAGC1基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高且在處理后3 h達(dá)到表達(dá)高峰，這暗示TaAGC1基因可能參與H2O2信號(hào)轉(zhuǎn)

10、導(dǎo)路徑。
　　（2）DAB和NBT染色結(jié)果顯示，紋枯菌的侵染誘導(dǎo)小麥植株產(chǎn)生大量的ROS（H2O2和O2?），TaAGC1基因過(guò)表達(dá)可以降低紋枯菌侵染引起的過(guò)量ROS的積累水平。qRT-PCR分析結(jié)果表明ROS消除相關(guān)基因POX2、CAT1和SOD3在TaAGC1過(guò)表達(dá)株系中的表達(dá)量顯著上調(diào)，而其在TaAGC1沉默表達(dá)植株中的表達(dá)量明顯降低；ROS合成關(guān)鍵基因NOX的表達(dá)模式與以上3個(gè)基因的相反，即在TaAGC1過(guò)表達(dá)中表達(dá)量最低