乳癌抑制基因Tob1的功能與輻射增敏作用研究.pdf

1、乳癌是女性最常見的惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、侵襲性強、發(fā)病早期即可發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移等特點，是危害女性健康的主要惡性疾病之一。乳癌的發(fā)生機制錯綜復雜，涉及大量基因或基因以外的變化和眾多相互交通的細胞信號通路，這為人們尋找安全理想的乳癌診療方法帶來極大挑戰(zhàn)。因此，對乳癌發(fā)生、發(fā)展機制的研究一直是近年來乳癌研究中的主要方向之一。 腫瘤抑制基因主要的生物學功能是通過抑制細胞的惡性轉(zhuǎn)化從而抑制腫瘤的發(fā)生，其編碼蛋白產(chǎn)物主要參與對細胞周期進程的調(diào)

2、控并能誘導細胞凋亡，此外還可參與對細胞間粘附力、蛋白酶活性等與腫瘤侵襲性或轉(zhuǎn)移性相關(guān)的功能調(diào)節(jié)；腫瘤抑制基因的突變或其正常功能的改變往往引起細胞惡性轉(zhuǎn)化，最終導致癌變。近年來對腫瘤抑制基因廣泛、深入的研究為乳癌的臨床診治提供了重要的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)，腫瘤抑制基因也因此成為乳癌發(fā)生機制中的一個研究熱點。 Tob1基因（transducer of ERBB2，1）屬于TOB/BTG抗增殖家族，已知該家族所有成員都具有抗細胞增殖活

3、性和細胞周期負性調(diào)控作用。眾多研究報道Tob1基因可通過對cyclin D1的表達調(diào)控參與對細胞周期進程的調(diào)控，并在多種人類腫瘤中均具有腫瘤抑制基因特征。然而Tob1在惡性腫瘤發(fā)生中的具體作用機制至今尚不完全清楚，其在乳癌發(fā)生、發(fā)展中的相關(guān)功能研究也未見報道。 本研究首先通過Western Blot法、Northern Blot法以及免疫組化染色法對多種人類乳癌細胞及乳癌組織中Tob1的表達情況進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在多種乳腺腫瘤

4、細胞及多數(shù)乳癌組織中Tob1的表達水平均有不同程度的下降或缺失。采用MTT生存分析法發(fā)現(xiàn)由重組腺病毒介導的外源性Tob1能顯著抑制乳癌細胞的生長；而在實驗動物模型中，Tob1的高水平表達還可以顯著抑制乳腺腫瘤的生長以及腫瘤新生血管的形成。綜合體內(nèi)、體外以及動物實驗結(jié)果，首次證實Tob1在乳癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮腫瘤抑制因子作用。 隨后，為闡明Tob1發(fā)揮乳癌抑制功能的具體作用機制，采用流式細胞術(shù)分析了Tob1的高水平表達對細胞

5、周期進程及細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示外源性Tob1可引起乳癌細胞中細胞周期G0/G1期以及G2/M期阻滯，并能顯著增加細胞凋亡的發(fā)生，這一結(jié)果與采用Western Blot法和RT—PCR法檢測到的細胞周期G1期調(diào)控關(guān)鍵因子cyclin D1的表達下降以及凋亡相關(guān)因子Bax的表達水平的下降相一致。 雌激素（estrogen）/雌激素受體（estrogen receptor，ER）信號通路的異常激活是乳癌發(fā)生的重要機制之一，本實驗采

6、用GST捕獲法、免疫共沉淀法等檢測了Tob1與ER間的相互作用。實驗中采用自行構(gòu)建的一系列可表達Tob1全長、各片段缺失體以及“LXXLL”模序突變體的重組表達質(zhì)粒載體進行Tob1的功能研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tob1可以和ER發(fā)生相互結(jié)合，而且這種結(jié)合作用與Tob1的氨基末端有關(guān)，但并不完全依賴于LXXLL模序。此外，熒光素酶活性測定結(jié)果顯示Tob1可顯著抑制ER的轉(zhuǎn)錄活性。上述結(jié)果共同提示Tob1可能通過雌激素/ER信號通路在乳癌的發(fā)生過程中

7、發(fā)揮重要生物學作用。 采用相同實驗方法，還檢測到Tob1不僅與ER信號通路下游關(guān)鍵調(diào)控因子cyclin D1存在體內(nèi)外相互作用，并能顯著抑制cyclin D1的轉(zhuǎn)錄活性。綜合Tobl對cyclin D1不同表達水平的調(diào)控作用，初步闡明了Tob1對乳癌的細胞周期進程及細胞生長產(chǎn)生影響的具體分子機制。 最后通過集落形成實驗、TUNEL法、宿主細胞修復實驗以及Western Blot法，首次證實重組腺病毒介導的Tob1高水平表

8、達可通過對受照射細胞中凋亡相關(guān)基因的表達調(diào)控，增強輻射誘導的細胞凋亡；外源性Tob1通過對DNA損傷修復通路中關(guān)鍵因子的表達調(diào)控，抑制受照射細胞的DNA損傷修復能力；Tob1可能分別通過上述機制增加人類乳癌細胞對電離輻射的敏感性。 總之，本研究首次證實Tob1可分別通過對細胞周期進程的調(diào)控以及對細胞周期凋亡的誘導發(fā)揮乳癌抑制因子作用，同時Tob1可通過對乳癌細胞中DNA損傷修復的調(diào)控作用而增強乳癌細胞對放射治療的敏感性。這些研究