MALAT1在LPS誘導的炎癥反應中的功能與機制研究.pdf

1、目的:
　　越來越多的研究結(jié)果顯示長鏈非編碼RNA在許多生理和病理過程中發(fā)揮非常重要的作用。MALAT1是一個在哺乳動物高度保守的lncRNA，主要與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，目前不清楚它是否參與免疫反應。本課題旨在揭示MALAT1在炎癥應答反應中的作用及機制，進一步豐富LncRNA在炎癥反應中的調(diào)控作用。
　　方法:
　　為了驗證MALAT1在炎癥反應中的作用，我們主要以PMA誘導分化的THP-1巨噬細胞為研究對象，qPC

2、R檢測了經(jīng)TLR4(Toll-like receptor4)配體LPS(Lipopolysaccharide)刺激后THP-1巨噬細胞中MALAT1的表達變化。我們通過qPCR及ELISA實驗檢測了siRNA敲減MALAT1后對炎癥因子TNFα、IL-6和IL-1β表達的影響。我們進行了NF-κB報告基因?qū)嶒?，檢測MALAT1對NF-κB活性的影響。通過qPCR以及Western blot檢測了MALAT1對p50、p65表達豐度的影響

3、以及ChIP-qPCR檢測了敲減MALAT1對NF-κB與靶基因TNFα、IL-6和IL-1β啟動子結(jié)合的影響來確定MALAT1調(diào)節(jié)NF-κB活性的機制。通過RIP實驗檢測了MALAT1與NF-κB的結(jié)合情況。為了驗證NF-κB對MALAT1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，我們做了NF-κB抑制劑實驗檢測了NF-κB對LPS誘導的MALAT1表達的作用。通過構(gòu)建MALAT1不同啟動子片段的報告質(zhì)粒以及候選NF-κB位點突變質(zhì)粒進行報告基因?qū)嶒烌炞CMALAT

4、1啟動子上是否存在NF-κB結(jié)合位點。最終通過ChIP檢測NF-κB與MALAT1啟動子的結(jié)合。
　　結(jié)果:
　　我們發(fā)現(xiàn)LPS能夠誘導MALAT1的表達，此外siRNA敲減MALAT1后促進了炎癥因子TNFα、IL-6的表達，而對IL-1β的表達沒有影響。NF-κB報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示MALAT1能夠抑制NF-κB活性。然而，我們發(fā)現(xiàn)MALAT1不影響p50和p65的表達豐度。通過ChIP，RIP實驗以及對MALAT1在細

5、胞中分布情況的分析，我們發(fā)現(xiàn)MALAT1在細胞核中與NF-κB的亞基p50、p65結(jié)合，抑制了NF-κB與TNFα和IL-6啟動子的結(jié)合。此外，我們發(fā)現(xiàn)NF-κB的抑制劑抑制了LPS誘導的MALAT1轉(zhuǎn)錄，暗示LPS誘導的MALAT1的轉(zhuǎn)錄依賴于NF-κB。我們還在MALAT1啟動子上確認了一個NF-κB的保守結(jié)合位點。ChIP-qPCR實驗證明了NF-κB與MALAT1啟動子結(jié)合，表明NF-κB對MALAT1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　結(jié)