MALAT1靶基因AKAP9在大腸癌的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制的初步研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中僅次于胃癌、食管癌和原發(fā)性肝癌，其發(fā)生率在我國有明顯增加趨勢(shì)。近些年來，雖然隨著診療新技術(shù)的應(yīng)用和化療藥物的不斷更新，結(jié)直腸癌患者的預(yù)后得到了極大地改善，但是患者總的生存率并沒有得到顯著提高，主要原因是多數(shù)結(jié)直腸癌患者在行根治性手術(shù)前已出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移。我們前期研究證實(shí)長非編碼RNA基因MALAT1(metastasis associatedlung adenocarcin

2、oma transcript1)即肺轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移關(guān)系十分密切，并且長非編碼RNA基因MALAT1可通過調(diào)控轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中起重要作用，其中AKAP9(A型激酶錨定蛋白9)基因是受MALAT1基因調(diào)控的重要靶基因之一。AKAP9是AKAPS家族中的一員。AKAP9蛋白定位于中心體、高爾基體等部位AKAP9基因定位于染色體7q21-q22，全長169.81Kb。AKAP9編碼基因中的1-8外顯子通過選擇性剪接

3、能產(chǎn)生多種異構(gòu)體，其中包括AKAP450、AKAP350、AKAP120和Yotiao等，Yotiao是AKAPS家族中的功能最活躍的一員，能激活PKA促進(jìn)Actin的表達(dá)。AKAP9與結(jié)直腸癌發(fā)病關(guān)系的研究尚處于起步階段，關(guān)于AKAP9與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的研究，國內(nèi)外還未見文獻(xiàn)報(bào)道。MALAT1調(diào)控AKAP9的機(jī)制以及AKAP9在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用還不清楚。已有研究表明MALAT1可以通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)SR蛋白而調(diào)控相關(guān)基因的可變剪接，因此我們

4、提出MALAT1通過調(diào)控SR蛋白并激活A(yù)KAP9-PKA-EMT信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的研究設(shè)想。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分：AKAP9在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)。運(yùn)用real-time PCR、和Western blot方法在基因和蛋白水平檢測(cè)AKAP9在8種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá);同時(shí)應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)S-P法，檢測(cè)8株結(jié)直腸癌細(xì)胞中AKAP9蛋白的表達(dá)情況。real-time PCR和Western blot檢

5、測(cè)了8種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中AKAP9的表達(dá)，結(jié)果表明，real-time PCR和Western blot檢測(cè)的結(jié)果比較一致。8株細(xì)胞中AKAP9均有表達(dá)，在高轉(zhuǎn)移的LOVO、SW620中表達(dá)較強(qiáng)，在由南方醫(yī)科大學(xué)病理科自建的具有高選擇肝臟轉(zhuǎn)移特性的SW480亞系SW480/M5細(xì)胞株中表達(dá)也較高，在結(jié)腸癌原發(fā)癌建系的SW480、HCT116、DLD1細(xì)胞株中為中低度表達(dá)，綜上，AKAP9在轉(zhuǎn)移性較高的結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)明顯高于無轉(zhuǎn)移性或

6、低轉(zhuǎn)移性大腸癌細(xì)胞。細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)AKAP9蛋白在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果表明:AKAP9蛋白表達(dá)的陽性信號(hào)定位于細(xì)胞漿內(nèi)，在HCT116，SW480，DLD1細(xì)胞株中，基本上是陰性表達(dá)，而在LOVO，HT29，LSI74T, SW620，M5中，AKAP9在這5株細(xì)胞中明顯表達(dá)高于HCT116，SW480，DLD1。
　　 第二部分：AKAP9在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義。收集南方醫(yī)院普外科54例新鮮結(jié)直腸癌組織和切緣

7、正常粘膜組織（距癌變邊緣10cm），手術(shù)切除后立即置于液氮中，常規(guī)-80℃冰箱凍存。進(jìn)行realtime-PCR反應(yīng)結(jié)果顯示:配對(duì)結(jié)直腸癌組織中AKAP9基因在癌組織中比正常組織中表達(dá)高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)其中AKAP9的表達(dá)與患者的年齡，性別，癌的分化程度無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.751，0.328，0.953)但與患者的轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)。同時(shí)收集南方醫(yī)院病理科存檔113例結(jié)直腸癌

8、蠟塊，所有標(biāo)本均由資深病理專家閱片確診，將蠟塊做2um連續(xù)切片，免疫組化采用常規(guī)SP試劑盒檢測(cè)不同分化程度原發(fā)部位結(jié)直腸癌及相應(yīng)正常結(jié)直腸粘膜組織中AKAP9蛋白，發(fā)現(xiàn)其與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。結(jié)果表明:AKAP9蛋白表達(dá)的陽性信號(hào)定位于細(xì)胞漿內(nèi)，在正常結(jié)直腸粘膜組織內(nèi)，基本上是陰性表達(dá)，在高、中、低分化的結(jié)直腸癌組織里，均有表達(dá)，AKAP9在癌組織中的表達(dá)高于正常組織。AKAP9表達(dá)的高低與病人的性別、腫瘤的分化程度沒有顯著性(P＞0

9、.05)，但是AKAP9表達(dá)的高低與腫瘤的浸潤程度差別具有顯著性(P＜0.05)，AKAP9蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌的浸潤程度高度相關(guān)，即AKAP9表達(dá)越高，結(jié)直腸癌浸潤程度就越高。
　　 第三部分：MALAT1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SR蛋白及AKAP9的調(diào)控作用初步分析。利用課題組前期建立的MALAT1核心功能區(qū)過表達(dá)載體pEGFP-C1-MALAT1/fgf已及pGPU6/GFP/NeoshRNA干擾載體，建立MALAT1核心功能區(qū)穩(wěn)定的

10、過表達(dá)細(xì)胞株和穩(wěn)定干擾的細(xì)胞株。采用RNA-FISH聯(lián)合免疫熒光檢測(cè)MALAT1與SR蛋白在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果表明:MALAT1過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株MALAT1-SW480-RNAa細(xì)胞中MALAT1 mRNA表達(dá)量高，紅色信號(hào)比較強(qiáng)，并且定位于細(xì)胞核，且與SR蛋白共定位比較多，與過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株MALAT1-SW480-RNAa相比，穩(wěn)定干擾細(xì)胞株MALAT1-SW480-RNAi紅色信號(hào)比較弱，MALAT1 mRNA表達(dá)量低，與

11、SR蛋白共定位比較少。通過RNA-IP檢測(cè)MALAT1與SR蛋白在結(jié)直腸癌細(xì)胞中結(jié)合和表達(dá)。結(jié)果表明:MALAT1-SW480-NC-SRSF1-IP對(duì)照組、MALAT1-SW480-RNAi-SRSF1-IP實(shí)驗(yàn)組、MALAT1-SW480-RNAa-SRSF1-IP實(shí)驗(yàn)組三組的MALAT1與SR蛋白結(jié)合的m RNA差異顯著(F=93.472，P＜0.001)。MALAT1-SW480-RNAa-SRSF1-IP實(shí)驗(yàn)組的MALAT1與

12、SR蛋白結(jié)合的mRNA表達(dá)最高。采用熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)MALAT1與AKAP9的關(guān)系，結(jié)果表明:結(jié)果表明Western blot的結(jié)果與熒光定量PCR得出的結(jié)果較為一致，在AKAP9在MALAT1-SW480-RMAa細(xì)胞表達(dá)較高，在MALAT1-SW480-RMAi表達(dá)較低。AKAP9在大腸癌細(xì)胞與大腸癌組織中均有表達(dá)，AKAP9的表達(dá)與大腸癌的浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān);MALAT1基因可能通過調(diào)控SR蛋白調(diào)節(jié)AKAP