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文檔簡介
1、C-型凝集素類似蛋白具有與C-型凝集素類似的結(jié)構(gòu),但沒有凝集素活性。蛇毒中C-型凝集素類似蛋白具有多種生物活性,包括抗凝血和血小板調(diào)節(jié)活性。凝血因子Ⅸ/凝血因子Ⅹ結(jié)合蛋白屬于C-型凝集素類似蛋白,它們廣泛存在于蝰科蛇毒中。它們都是通過與血液中凝血因子Ⅸ或者凝血因子Ⅹ結(jié)合來抑制凝血反應(yīng),所有結(jié)合反應(yīng)都依賴于Ca2+等離子。尖吻蝮蛇蛇毒中抗凝血因子Ⅰ(ACFⅠ)和抗凝血因子Ⅱ(ACFⅡ)是凝血因子Ⅸ/Ⅹ結(jié)合蛋白家族中的兩個新成員。本論文主要
2、研究金屬離子對ACFⅠ和ACFⅡ的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能的影響、ACFⅠ和ACFⅡ?qū)ρ貉h(huán)系統(tǒng)的影響以及它們在親和純化凝血因子Ⅸ和凝血因子Ⅹ方面的應(yīng)用。全文分為四章。
第一章:我們對凝血過程分子機理、凝血因子Ⅸ和凝血因子Ⅹ等重要凝血因子的性質(zhì)和功能、凝血因子Ⅸ和凝血因子Ⅹ純化技術(shù)、C-型凝集素類似蛋白以及凝血因子Ⅸ/Ⅹ結(jié)合蛋白家族等進行了綜述。
第二章:我們研究了ACFⅠ和ACFⅡ在體內(nèi)抗凝血活性、堿土金屬離子與
3、ACFⅠ和ACFⅡ的結(jié)合反應(yīng)以及它們對ACFⅠ和ACFⅡ的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能的影響。ACFⅠ和ACFⅡ在老鼠體內(nèi)表現(xiàn)出顯著的抗凝血活性,它們都顯著延長APTT和PT,都對TT沒有影響,表明它們的抗凝血作用與抑制凝血因子Ⅸ/Ⅹ活性有關(guān)。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和表面等離子共振的結(jié)果都顯示,ACFⅡ與FXa結(jié)合反應(yīng)不是絕對依賴于Ca2+,Mg2+、Sr2+和Ba2+也可以誘導(dǎo)ACFⅡ與FXa結(jié)合反應(yīng)。與ACFⅡ結(jié)合的金屬離子半徑不僅顯著影響金
4、屬離子與ACFⅡ結(jié)合親和性,而且也顯著影響ACFⅡ抗GdnHCl變性和熱變性的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。而與凝血因子Ⅹ結(jié)合的金屬離子半徑顯著影響ACFⅡ與FX結(jié)合親和性。金屬離子對ACFⅡ親和性強弱和金屬離子誘導(dǎo)ACFⅡ結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的能力大小遵循相同順序:Ca2+>Sr2+>Ba2+。而金屬離子誘導(dǎo)的ACFⅡ與FX結(jié)合反應(yīng)的能力大小為:Mg2+>Ca2+>Sr2+>Ba2+。雖然Mg2+對ACFⅡ的親和性最低,但Mg2+誘導(dǎo)ACFⅡ與FX結(jié)合反應(yīng)能力最
5、強。我們的實驗結(jié)果表明,金屬離子與ACFⅡ結(jié)合能顯著增強ACFⅡ結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,但金屬離子與ACFⅡ的結(jié)合反應(yīng)不是ACFⅡ與FXa發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的前提條件;金屬離子與FXa結(jié)合反應(yīng)才是ACFⅡ與FXa相互識別的前提條件。另外,ACFⅡ是基于金屬離子半徑選擇結(jié)合Ca2+。
第三章:我們利用凝血因子Ⅸ/Ⅹ結(jié)合蛋白作為親和配基,建立了快速高效親和純化凝血因子Ⅸ和凝血因子Ⅹ的方法。新配基結(jié)合凝血因子Ⅸ及凝血因子Ⅹ的親和能力強,而且在溫和
6、的條件下就可以方便地洗脫下來凝血因子Ⅸ和凝血因子Ⅹ。通過凝血因子Ⅸ/Ⅹ結(jié)合蛋白親和柱層析,可以直接從任何血漿中分離出僅含有凝血因子Ⅸ和凝血因子ⅩX的混合物。再經(jīng)過FPLC共兩步色譜就可同時得到高純度的凝血因子Ⅸ和凝血因子Ⅹ。該方法純化效率和產(chǎn)率與單克隆抗體親和層析方法相當。單克隆抗體的制備方法繁瑣,抗體價格昂貴,而抗體不穩(wěn)定。而新配基凝血因子Ⅸ/Ⅹ結(jié)合蛋白是天然配基,長期穩(wěn)定,價格便宜,很方便大規(guī)模工業(yè)制備。另外,用單克隆抗體親和層析只
7、能從一個特定動物血漿中純化一種凝血因子,而用新親和層析方法可以從任何血漿和溶液中同時純化出凝血因子Ⅸ和凝血因子Ⅹ。因此新親和層析方法可在工業(yè)上用來大規(guī)模純化凝血因子Ⅸ和凝血因子Ⅹ,以便為B型血友病患者提供高純而廉價的凝血因子Ⅸ。
第四章:我們研究了ACFⅠ和ACFⅡ?qū)Υ笫笱貉h(huán)系統(tǒng)的影響,發(fā)現(xiàn)ACFⅡ具有顯著的降血壓活性,但對心率沒有產(chǎn)生顯著的影響。靜脈注射ACFⅡ能迅速導(dǎo)致大鼠血壓顯著下降并在幾十秒后達到最大下降幅度,
8、接著血壓緩慢升高,恢復(fù)到明顯低于給藥前水平的平臺值,并長期維持這個較低血壓的平臺狀態(tài)。在體外,ACFⅡ能誘導(dǎo)血管舒張。血管內(nèi)皮細胞中有一氧化氮(NO)合成酶,該酶合成NO。NO是信號分子,它能誘導(dǎo)血管平滑肌舒張。N-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)是NO合成酶抑制劑。在體外,L-NAME能顯著抑制ACFⅡ的舒張血管活性:在體內(nèi),L-NAME能顯著抑制ACFⅡ的降血壓活性。由此可知,ACFⅡ通過NO信號途徑誘導(dǎo)血管舒張從而導(dǎo)致血壓下降。因此
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