人早孕期絨毛中TET及5-hmC表達(dá)下調(diào)及流產(chǎn)絨毛組織中去甲基化異常的相關(guān)研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分TET酶及5-mC，5-hmC在人類早孕期絨毛組織中的表達(dá)趨勢(shì)
　　目的：
　　多項(xiàng)研究已闡明TET蛋白及催化生成的5-hmC參與了胚胎干細(xì)胞的維持和分化過程，去甲基化可能存在于原生殖細(xì)胞和胚胎早期發(fā)育的各個(gè)階段。最近的一篇報(bào)道，在豬的早孕胚胎中，TET3在2細(xì)胞期高表達(dá)，而TET1，TET2則富集在囊泡階段。TET1，TET2，TET3三種蛋白都有不同組織及細(xì)胞內(nèi)將5-m

2、C轉(zhuǎn)變成5-hmC的功能。TET蛋白和5-hmC的研究為DNA甲基化/去甲基化及其生物學(xué)功能提供了新的視點(diǎn)，關(guān)于它們的表達(dá)及功能在人類絨毛組織中的研究有限?；钴S的DNA甲基化及去甲基化在即將發(fā)育成胚胎與即將發(fā)育成胚外譜系的細(xì)胞間發(fā)揮著重要的作用，無論是胚胎種植前還是種植后。絨毛組織的生物學(xué)功能類似于胚胎干細(xì)胞，那么TET酶及5-mC，5-hmC在人類早孕期絨毛組織中的表達(dá)量及表達(dá)趨勢(shì)是怎樣的呢？我們對(duì)此做一研究。
　　方法：

3、>　　1.本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，標(biāo)本收集經(jīng)患者知情同意。2012年9月至2013年5月于廣州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診收集:自愿選擇終止妊娠婦女的正常絨毛31例。絨毛樣本均為孕6-8+6周，母齡18-42歲。根據(jù)絨毛組織的不同發(fā)育時(shí)期分為3個(gè)研究組:①6周(n=10)，②7周(n=10)，③8周(n=11)。
　　2.人流手術(shù)后，即用生理鹽水漂洗2-3次以去除絨毛組織上帶有的血跡，采用50ml無菌離心管收集絨毛組織，內(nèi)置

4、1×PBS溶液，顯微鏡下挑選、剪取絨毛組織，分裝入1.5ml EP管內(nèi)，凍存-80°。首先進(jìn)行TET mRNA的檢測(cè):應(yīng)用BiooPure RNA Isolation Reagent(Bioo，USA)提取絨毛組織RNA，RNA的純度和濃度鑒定后行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（Fermentas K1622嚴(yán)格按照試劑操作說明）。RNA水平實(shí)驗(yàn)得出初步結(jié)論后，Western-bloting方法用于TET蛋白表達(dá)的驗(yàn)證:絨毛組織組織總蛋白的提取，蛋白質(zhì)變性

5、、轉(zhuǎn)膜、封閉及抗體孵育、顯影及圖像分析，完成實(shí)驗(yàn)。最后一步，全基因組5-hmC及5-mC的定量檢測(cè)。采用Wizard(R)Genomic DNA Purification Kit(Promega)試劑盒提取DNA，DNA的純度和濃度鑒定后，嚴(yán)格按照（Epigentek公司） MethylFlashHydroxymethylated DNA Quantification Kit及MethylFlash Methylated DNAQuan

6、tification Kit操作說明書操作，檢測(cè)樣品的上樣檢測(cè)量是200ng。
　　3.采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件(Statistical Package for the Social Sciences)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x±E）表示。組間數(shù)量資料比較采用t-test或One-way ANOVA，方差不齊時(shí)采用Welch近似方差檢驗(yàn)，雙變量相關(guān)分析。設(shè)雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著水平，P＜0.01為差異極顯著水平。

7、>　　結(jié)果：
　　1.采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)TET1，TET2，TET3 mRNA在人類早孕絨毛組織中的表達(dá)情況，TET1，TET2，TET3的表達(dá)均會(huì)隨著孕周的增加而下降，尤以TET3下降明顯(6周vs.7周，P＜0.05;6周vs.8周，P＜0.05)。三種TET mRNA均在孕6周的絨毛組織中表達(dá)是最高的，與孕8周組相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.我們應(yīng)用Western-bloting的方法驗(yàn)證了TET1，TET

8、2，TET3蛋白在人類早孕絨毛組織中的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了TET mRNA水平上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)過程中所應(yīng)用標(biāo)本與RT-PCR中一致，TET1，TET2，TET3蛋白的表達(dá)同樣會(huì)隨著孕周的增加而下降，而且在各組之間的表達(dá)存在著明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在孕6周組，TET1，TET2，TET3蛋白的表達(dá)明顯高于孕7周組和孕8周組。在7周和8周的組間比較上未得到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果。
　　3. 5-hmC在早孕絨毛組織中的表達(dá)與TET酶的表達(dá)趨勢(shì)比

9、較一致，隨著孕周數(shù)的增加，表達(dá)量下降。以孕6周的絨毛組織中表達(dá)最高（6周vs7周，P＜0.01;6周vs8周，P＜0.01）。同時(shí)，5-mC在早孕絨毛組織中的表達(dá)也會(huì)隨著TET酶的表達(dá)量的減少而呈下降趨勢(shì)(6周vs8周，P＜0.01;7周vs8周，P＜0.01)，在孕6周時(shí)表達(dá)量顯著高于其它孕周數(shù)（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.本研究發(fā)現(xiàn)TET1，TET2，和TET3 mRNA在人類早孕期絨毛組織中的表達(dá)是隨著孕周的

10、增加而逐步下降的（6周，7周，8周）。顯而易見，在這三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的比較中，TET1，TET2，和TET3 mRNA在孕6周時(shí)表達(dá)最旺盛。同樣的標(biāo)本，TET蛋白的半定量檢測(cè)同時(shí)證明了這一下降趨勢(shì)的存在。
　　2.TET1、TET2、TET3在早期妊娠發(fā)育過程中確有在母胎界面的絨毛組織中表達(dá)，并且在孕6-8周的階段，有逐漸減弱的趨勢(shì)。3個(gè)TET蛋白在早孕絨毛組織內(nèi)可能發(fā)揮著將5-mC轉(zhuǎn)變成5-hmC的作用。
　　3. 5-hmC及

11、5-mC在早孕絨毛組織中的表達(dá)與TET酶的表達(dá)趨勢(shì)比較一致，隨著孕周數(shù)的增加，表達(dá)量下降，并以孕6周的絨毛組織中表達(dá)最高，孕8周時(shí)表達(dá)最低。由此猜測(cè)，在早期妊娠自孕6周進(jìn)展到孕8周的階段的絨毛組織中，無論是甲基化的過程，亦或是去甲基化的過程都在減弱。
　　第二部分TET酶的缺乏及相關(guān)的去甲基化異常與人類早期自然流產(chǎn)的相關(guān)性研究
　　目的：
　　本部分?jǐn)M從不同時(shí)期、不同類型停止發(fā)育的早孕絨毛組織的甲基化/去甲基化動(dòng)態(tài)變化

12、的角度，研究TET蛋白，5-mC，5-hmC在人類早孕絨毛組織中全基因組的變化模式，分析去甲基化與自然流產(chǎn)的病因和發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系。
　　方法：
　　(1)本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，標(biāo)本收集經(jīng)患者知情同意。2012年9月至2013年5月于廣州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診收集:自愿選擇終止妊娠婦女的正常絨毛31例。2012年5月至2013年5月于廣州市婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科門診收集:早期胚胎停止發(fā)育的絨毛30例。絨毛樣本均為

13、孕6-8+6周，母齡18-42歲。收集人早孕期絨毛組織分為兩組:一組為胚胎停育，作為研究組（EPL組）;二組為正常妊娠，作為對(duì)照組。
　　(2)獲取絨毛組織后，即用生理鹽水漂洗2-3次以去除絨毛組織上帶有的血跡，采用50ml無菌離心管收集絨毛組織，內(nèi)置1×PBS溶液，顯微鏡下挑選、剪取絨毛組織，分裝入1.5ml EP管內(nèi)，凍存-80。
　　(3)采用t-test或One-way ANOVA進(jìn)行組間數(shù)量資料比較，方差不齊時(shí)采用

14、Welch近似方差檢驗(yàn)。設(shè)雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異極顯著水平。應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤((x)±E)表示。
　　結(jié)果：
　　1.正常妊娠組的TET1，TET2，TET3 mRNA水平均高于EPL組(TET1 P＜0.01，TET2 P＜0.01，TET3 P＜0.05)。也就是說，在孕6-8周的早期妊娠中，與正常妊娠相比，流產(chǎn)的絨毛組織中三種TET mRNA的含量有

15、所下降。在EPL組中，以孕周數(shù)作為分組依據(jù)的三個(gè)亞組中，三種TET mRNA的表達(dá)在孕6周，7周，8周組之間比較無顯著差別(P＞0.05)。另外根據(jù)臨床類型分組中，無論是在空囊型的早孕絨毛，有胚芽無胎心型流產(chǎn)的早孕絨毛，還是已有胎心后停育型的流產(chǎn)絨毛組織中，TET1，TET2，TET3 mRNA表達(dá)均未見差別。
　　2.TET1，TET2和TET3蛋白的表達(dá)隨著孕周的增加而下降，以EPL組的明顯減弱。在孕6周組中，TET1，TET

16、2，TET3蛋白的表達(dá)明顯高于孕7周組和孕8周組以及EPL組。免疫組化圖片顯示:TET1，TET2和TET3主要表達(dá)于絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞，呈以細(xì)胞漿為主的表達(dá)，細(xì)胞核為陰性反應(yīng)。仍然是表達(dá)在孕6周時(shí)最為明顯。
　　3. 5-mC在正常妊娠的絨毛組織中表達(dá)低于在流產(chǎn)的絨毛組織中的表達(dá)，差異達(dá)到顯著水平。但是，5-hmC在絨毛組織中的表達(dá)量整體偏低，流產(chǎn)組與對(duì)照組的比較無差別。
　　結(jié)論：
　　1.與正常妊娠相比，TET1，TE

17、T2，TET3 mRNA在流產(chǎn)組中表達(dá)量明顯降低，western-bloting和免疫組化的蛋白檢測(cè)方法同時(shí)證明了這種趨勢(shì)的存在。
　　2.我們成功的完成了絨毛組織中TET酶的Western-bloting和免疫組化實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了TET酶在人類早孕絨毛組織中是確實(shí)存在的，也就是說在早孕期間的母胎界面，存在著去甲基化的過程。在免疫組化的圖片上可以看到TET表達(dá)在滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)，無論是細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞還是合體滋養(yǎng)細(xì)胞，均可見TET