骨髓增生異常綜合征TET2突變及5-hmC水平分析和預(yù)后評估研究.pdf

1、骨髓增生異常綜合征(MDS)是一組起源于造血干細胞的異質(zhì)性克隆性疾病，主要特征是骨髓無效造血和具有高危向急性髓系白血病演變的傾向。在世界衛(wèi)生組織2008年血液腫瘤分類系統(tǒng)中原發(fā)性MDS成為五大類髓系惡性腫瘤之一。作為一種高度異質(zhì)性的惡性克隆性疾病，MDS發(fā)病的分子機制尚未明確。新近研究發(fā)現(xiàn)多個基因的突變與MDS發(fā)生發(fā)展及向AML轉(zhuǎn)化有關(guān)，尤其是調(diào)節(jié)組蛋白修飾及DNA甲基化的基因，如DNMT3A、EZH2、IDH及TET2等，在MDS發(fā)生

2、較高頻率突變的現(xiàn)象，提示MDS發(fā)病相關(guān)的分子遺傳學和表觀遺傳學機制存在著某種聯(lián)系。
　　TET2是一種腫瘤抑制基因，而且是迄今為止在MDS相關(guān)基因突變中發(fā)現(xiàn)的最為常見的突變基因。作為一種依賴α-KG及Fe(Ⅱ)的氧化酶，TET2可催化5-mC轉(zhuǎn)變?yōu)?-hmC，5-hmC的形成導致胞嘧啶去甲基化改變。作為一種新的表觀遺傳學分子標志，5-hmC的發(fā)現(xiàn)推動人類基因組中去甲基化研究的進展。
　　我們觀察了61例MDS患者中TET2基

3、因突變對5-hmC水平的影響，研究了TET2突變及5-hmC含量變化與P15及hMSH2基因甲基化的關(guān)系，分析了TET2突變及5-hmC異常與MDS臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，旨在為MDS的發(fā)病機制及預(yù)后評估提供實驗依據(jù)。
　　我們采用基因組PCR擴增直接測序方法對MDS患者骨髓單個核細胞中TET2基因所有的外顯子進行測序，以確定MDS患者TET2突變類型及突變發(fā)生率，同時也檢測了TET2相關(guān)基因IDH1、IDH2的突變。結(jié)果顯示:TE

4、T2基因在61例MDS患者中的突變率為16.39％（95％CI，7.10％-25.68％），突變以移碼突變多見，較集中于第一保守結(jié)構(gòu)域。具有TET2突變患者外周血中性粒細胞計數(shù)高于TET2未突變者。61例MDS患者中未發(fā)現(xiàn)IDH1及IDH2基因突變，提示IDH1及IDH2基因并不是MDS患者的常見突變基因。為了進一步研究TET2基因突變對全基因組5-hmC含量的影響，我們使用5-hmC定量分析法測定了骨髓單個核細胞中5-hmC含量。標準

5、曲線絕對定量法結(jié)果顯示:MDS患者5-hmC含量顯著低于對照組，并且骨髓原始細胞比例高者其5-hmC含量更低;進一步采用免疫磁珠分離骨髓CD34+細胞并測定其5-hmC含量，結(jié)果示:CD34+細胞中5-hmC含量低于CD34-細胞，且在MDS患者的CD34+細胞中較正常對照的CD34+細胞中5-hmC含量降低更明顯，提示5-hmC可能與細胞分化有關(guān)。我們的結(jié)果也顯示:TET2突變患者的5-hmC含量降低，在一定程度上反映出TET2突變影

6、響了其催化功能。
　　為了探討TET2基因突變及5-hmC水平改變對其他基因甲基化的影響，我們選取細胞周期調(diào)節(jié)蛋白P15及人類錯配修復(fù)基因hMSH2，利用甲基化特異性PCR及實時定量PCR檢測了MDS患者骨髓單個核細胞中TET2、P15及hMSH2基因的甲基化狀態(tài)及表達水平。結(jié)果顯示:MDS患者中未發(fā)現(xiàn)TET2基因甲基化，而在IPSS-R較高危組MDS患者存在P15及hMSH2的高甲基化改變，并且與患者的5-hmC含量減少及TET

7、2表達下降相關(guān);P15和hMSH2基因的mRNA表達均與5-hMC水平呈正相關(guān)，提示MDS患者中TET2及5-hmC與P15及hMSH2甲基化存在某種內(nèi)在聯(lián)系。
　　我們采用Kaplan-Meier及Cox比例風險模型對MDS患者進行生存分析，以研究TET2突變及5-hmC對MDS患者預(yù)后的影響。結(jié)果顯示:隨著IPSS-R危險度增高，本組MDS患者的2年總生存率降低;更有意義的是，高5-hmC水平與MDS患者較長生存期有關(guān)，提示5