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文檔簡介
1、研究背景 多藥耐藥(multi-drug resistance MDR)是腫瘤以及白血病治療失敗的主要原因,多年來一直困擾臨床血液及腫瘤工作者。多藥耐藥產(chǎn)生的機制是復雜的,除有藥物外排泵作用、細胞內(nèi)解毒酶機制加強、DNA修復功能加強外,耐藥細胞的抗凋亡機制是不容忽視的。多藥耐藥蛋白P-gp和MRP是ABC家族成員,在細胞膜形成ATP依賴的蛋白通道將藥物排出細胞外,保護細胞免受藥物攻擊,P-gp還具有抑制caspase-8活化、阻斷cas
2、pase(caspase-dependent apoptosis)途徑凋亡的作用。目前耐藥逆轉(zhuǎn)策略主要是針對耐藥發(fā)生機制的位點,但是因為藥物的毒副作用或耐藥機制的復雜性尚未解決臨床問題。 氯霉素(chloramphenicol CAP)是一種小分子脂溶性物質(zhì),因?qū)毦鶶亞基的抑制作用應用于臨床,是線粒體蛋白質(zhì)合成抑制劑,具有損傷骨髓造血細胞、抑制造血功能特點。在本研究中發(fā)現(xiàn)CAP具有抑制血液腫瘤細胞生長的作用,對白血病多
3、藥耐藥細胞作用較敏感細胞更強,因此設想通過對CAP作用機制的研究來探討克服白血病多藥耐藥的途徑,通過研究的逐步進行及各種研究文獻的復習,發(fā)現(xiàn)直接損傷細胞的能量中心及誘發(fā)細胞凋亡的關鍵部位線粒體,能阻斷細胞能量來源并誘發(fā)細胞凋亡,從而繞過線粒體以上耐藥機制位點,達到殺滅耐藥腫瘤細胞的目的。 研究目的 1、觀察CAP體外抑制血液腫瘤生長作用及對白血病細胞及白血病多藥耐藥細胞的細胞周期影響。2、探討CAP誘導細胞凋亡的作用及凋亡途徑。
4、3、觀察CAP引起K562、K562/A02細胞線粒體損傷的超微結構變化及線粒體膜電位改變。4、觀察CAP對K562/A02多藥耐藥細胞的細胞膜外排泵作用的影響,及對K562/A02細胞P-gp表達的作用。5、觀察CAP對不同組織來源細胞作用的差異,判斷CAP作用是否具有組織特異性。6、建立K562白血病細胞及K562/A02多藥耐藥細胞同鼠移植模型,觀察CAP對白血病細胞及白血病多藥耐藥細胞的體內(nèi)作用。本研究初步觀察線粒體抑制劑CA
5、P對白血病細胞及白血病細胞多藥耐藥細胞的作用,探討線粒體損傷克服白血病多藥耐藥的作用。 研究方法 1、觀察CAP對白血病細胞及白血病多藥耐藥細胞的體外作用 1.1 用MTT方法測定CAP體外抗腫瘤活性,觀察CAP對白血病細胞的生長抑制作用 1.2 觀察CAP對白血病細胞周期的影響 K562、K562/A02、HL60、HL60/ADR細胞系經(jīng)予CAP處理后,行PI染色,用流式細胞術進行細胞周期檢
6、測分析。 1.3 確定細胞凋亡 (1) 用Annexin-V檢測試劑盒對CAP處理的細胞進行標記, 流式細胞術檢測早期凋亡細胞率 (2) 瓊脂糖凝膠電泳觀察凋亡細胞的DNA條帶。 1.4 判斷CAP誘導凋亡的途徑 用Western blot方法觀察經(jīng)CAP處理后,K562、K562/A02細胞系細胞色素-C自線粒體向細胞漿的釋放;用流式細胞術檢測細胞內(nèi)活化的caspas
7、e-3、8、9,同時觀察caspase途徑廣泛阻斷劑Z-VAD-fmk對caspase-3、8、9的阻斷作用,以確定CAP誘導細胞凋亡的途徑。 1.5 觀察CAP作用后細胞超微結構的變化 用透射電子顯微鏡觀察CAP處理后K5 62、K562/A02、HL60及HL60/ADR細胞的超微結構變化;用羅丹明作為線粒體標記物,共聚焦顯微鏡觀察線粒體熒光變化,流式細胞術同步測定胞內(nèi)熒光強度,以確定線粒體活性變化。 1
8、.6 線粒體膜電位測定 用JC-1標記線粒體,流式細胞儀測定細胞內(nèi)熒光強度,判斷CAP作用前后線粒體膜電位變化。 1.7 CAP對P-gp藥物外排泵功能的影響 應用流式細胞儀檢測 CAP作用后耐藥細胞K562/A02對Rhodanminl 23攝取率及ADR攝取率的變化,觀察CAP對K562/A02細胞膜的藥物外排泵的作用。 2、觀察CAP對K562、K562/A02白血病細胞的體內(nèi)作用
9、 建立人類K562、K562/A02白血病細胞同鼠移植模型,分組應用CAP、DNR治療,設立陰性治療對照組,觀察治療后腫瘤體積變化及體重變化,并檢測腫瘤細胞凋亡率,同時觀察移植瘤和組織臟器病理形態(tài)改變。 研究結果 1、CAP對血液腫瘤細胞具有生長抑制作用及周期抑制作用,此作用具有時間依賴性及劑量依賴性;CAP使細胞阻滯于G0-G1期,S期細胞減少。 2、CAP誘導K562、K562/A02、HL60、
10、HL60/ADR細胞凋亡,25 μg/ml CAP作用24小時即可觀察到早期凋亡,50 μ g/ml CAP作用72小時出現(xiàn)DNA凋亡條帶。 3、CAP促進細胞色素-C釋放及促caspase-9、caspase-3活化,而對caspase-8活化無作用,caspase阻斷劑ZAVD-FMK不能完全阻斷caspase-9、caspase-3的釋放,顯示CAP通過caspase非依賴途徑(caspase-independent
11、pathway)誘導細胞凋亡。 4、電鏡下觀察發(fā)現(xiàn),CAP作用后K562、K562/A02細胞線粒體腫脹,呈花瓣樣及車輪樣變;K562/A02細胞線粒體空泡樣變,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、增殖,并出現(xiàn)線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)融合現(xiàn)象。 5、共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)線粒體熒光強度的變化:經(jīng)’Verapamia阻斷細胞膜P-gp功能后耐藥細胞熒光強度較敏感細胞增強;25 μ g/mlCAP作用12小時,K562、K562/A025細胞熒光強度
12、有所增加; 50 μg/m1CAP作用后細胞熒光強度減弱。說明耐藥細胞較敏感細胞線粒體分布或活性增強,CAP可以使線粒體功能發(fā)生改變。同步流式細胞儀對胞內(nèi)Rho 123熒光強度檢測提示,在一定的條件下,CAP改變耐藥細胞膜的外排功能,當超過一定濃度線粒體受損傷。 6、50 μg/ml CAP作用K562、K562/A02細胞1 2小時后,用線粒體標記探針JC-1進行標記,流式細胞術檢測結果證實,在細胞凋亡前CAP誘導線粒
13、體膜電位下降。 7、流試細胞術對K562/A02胞內(nèi)藥物濃度檢測顯示,CAP可促進K562/A02細胞對阿霉素及羅丹明攝取率。 8、CAP對K562、K562/A02移植瘤有抑制作用,對K562/A02移植瘤抑制作用較K562移植瘤顯著。CAP誘發(fā)K5 62/A02細胞凋亡及病理形態(tài)死亡。 9、CAP對乳腺癌細胞系MCF-7,口腔癌KB細胞,血管內(nèi)皮細胞系EvC抑制作用較血液腫瘤明顯減低,其IC50值達
14、150mg/L以上,無臨床作用意義。 結論 1、CAP對多種血液腫瘤細胞具有生長抑制作用及周期阻止作用。2、25-50mg/L CAP作用24小時可出現(xiàn)K562、K562/A02、HL60、HL60/ADR白血病細胞凋亡,CAP通過促進細胞色素-C釋放、caspase-3及caspase-9活化、線粒體膜電位下降,誘導白血病細胞通過線粒體途徑凋亡。3、K562/A02細胞線粒體較K562細胞豐富,線粒體活性增強。CAP
15、可引起K562、K562/A02細胞線粒體腫脹、車輪樣變,而K562/A02細胞出現(xiàn)空泡變性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體融合現(xiàn)象。4、CAP具有抑制MDR細胞膜的藥物外排作用。5、CAP具有體內(nèi)抑制K562/A02及K562移植瘤生長作用,在一定的用藥范圍內(nèi)無明顯毒副作用。6、初步觀察CAP對部分髓外細胞系無臨床意義的生長抑制作用。 研究意義 白血病多藥耐藥一直是血液腫瘤界需要解決的臨床問題,人們通過對大量的基礎及臨床研究,探討
16、耐藥機制,尋找耐藥逆轉(zhuǎn)策略,但目前臨床應用中有各種不足。目前己發(fā)現(xiàn)耐藥基因的作用可能是多元性的,單一的阻斷某一位點可能不能完全阻斷耐藥的作用。我們通過本研究發(fā)現(xiàn),線粒體損傷不但能阻斷多藥耐藥細胞ATP供能,增加胞內(nèi)的藥物濃度,并且誘導白血病多藥耐藥細胞凋亡,是克服白血病多藥耐藥的一個有效治療靶點。1、此研究首次進行線粒體蛋白抑制劑CAP對白血病多藥耐藥細胞作用的研究,并證實體內(nèi)體外對白血病多藥耐藥細胞作用的有效性。2、證實CAP通過線粒
17、體途徑誘導白血病細胞及多藥耐藥細胞凋亡。3、透射電鏡下觀察CAP作用后K562細胞與K5 62/A02細胞線粒體的變化,及他們之間的差異。并觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體融合的結構,提示CAP誘導的細胞凋亡主要是線粒體損傷,也可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑凋亡有關。4、首次在共聚焦顯微鏡下觀察CAP作用后K562與K562/A02細胞線粒體的變化,以及他們之間的差異。提示敏感細胞與耐藥細胞之間線粒體的差異可能決定了細胞對CAP敏感性,是線粒體途徑誘導凋亡的基
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