5-HT3R亞型非翻譯區(qū)多態(tài)性與IBS-D的關(guān)聯(lián)及機(jī)制研究.pdf

1、腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome，IBS)是一種常見的功能性胃腸病。依據(jù)羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)，它以慢性腹部不適或腹痛、腹脹以及腸道功能的變化為特征。研究表明IBS全球的發(fā)病率為5％-15％，女性的發(fā)病率是男性的兩倍，臨床上以腹瀉型腸易激綜合征(Diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D)較為多見。雖然IBS-D不會導(dǎo)致像腸癌一樣的嚴(yán)重疾病，但是多數(shù)罹患人

2、群必須通過應(yīng)激的管理、飲食的控制等等來避免腹瀉、腹痛的發(fā)生，使得生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，失業(yè)率嚴(yán)重上升，增加了巨額醫(yī)療花費(fèi)。
　　本研究首先采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）對IBS-D患者與健康對照者5-HT3A基因5'端非翻譯區(qū)(5'UTR) c.-42C＞T(rs1062613)和5-HT3E基因3'UTR c.*76G＞A(rs56109847)進(jìn)行研究。探討這兩種SNP與IBS-D的發(fā)生及癥狀的關(guān)聯(lián)

3、。其次通過生物信息學(xué)預(yù)測及文獻(xiàn)資料，查找與5-HT3E基因3'UTR中的SNPrs56109847有潛在結(jié)合能力的miRNA，通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對5-HT3E3'UTRSNP rs56109847進(jìn)行功能研究。再次，通過5-HT3E不同基因型IBS-D患者結(jié)腸粘膜5-HT3E表達(dá)的分析了解SNP對腸道5-HT3E表達(dá)的影響。最后探討了IBS-D重疊PMS患者中醫(yī)證型及婦科經(jīng)歷、腸道癥狀和心理癥狀的特點(diǎn)。
　　研究內(nèi)容分為5

4、部分:
　　1. 5-HT3A、5-HT3E基因非翻譯區(qū)多態(tài)性與中國揚(yáng)州地區(qū)漢族人群IBS-D的關(guān)聯(lián)研究
　　目的:探討揚(yáng)州地區(qū)門診IBS-D與5-HT3R的亞型5-HT3A、5-HT3E基因非翻譯區(qū)多態(tài)性的關(guān)系。
　　方法:采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)對450例IBS-D患者與300例健康對照者5-HT3A基因5'UTR c.-42C＞T(rs1062613)和5-HT3E基因3'U

5、TR c.*76G＞A(rs56109847)進(jìn)行研究。
　　結(jié)果:男女性患者5-HT3A c.-42C＞T多態(tài)性位點(diǎn)基因型分布較正常對照的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且T等位基因的頻率與正常對照比較均有顯著增高;女性患者5-HT3E c.*76G＞A多態(tài)性位點(diǎn)GA基因型和A等位基因的頻率較正常對照均顯著升高，男性兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與5-HT3A基因的rs1062613位點(diǎn)CC基因型及5-HT3E基因的rs56109847位點(diǎn)GG基

6、因型相比，TT基因型及GA基因型與女性IBS-D密切相關(guān)。
　　結(jié)論:5-HT3A基因rs1062613位點(diǎn)T等位基因和5-HT3E基因rs56109847位點(diǎn)的GA基因型分別是中國揚(yáng)州地區(qū)漢族人群IBS-D患者和IBS-D女性患者的重要易感因素之一。
　　2. 5-HT3A、5-HT3E基因非翻譯區(qū)多態(tài)性與女性IBS-D癥狀的關(guān)聯(lián)研究
　　目的:探討5-HT3R的亞型5-HT3A和5-HT3E基因非翻譯區(qū)多態(tài)性與非絕

7、經(jīng)期女性IBS-D患者腸道和心理癥狀的關(guān)聯(lián)。
　　方法:采用PCR-RFLP方法對104例非絕經(jīng)期IBS-D女性患者5-HT3A基因5'UTRc.-42C＞T(rs1062613)和5-HT3E基因3'UTR c.*76G＞A(rs56109847)進(jìn)行研究。
　　結(jié)果:5-HT3E GA基因型患者較GG基因型腹脹頻率更高，兩組患者排便性狀也存在很大差異;5-HT3A TT基因型患者較C等位基因攜帶者有更加頻繁的排便急迫感和

8、不盡感，兩組患者排便性狀也存在很大差異;5-HT3A CC基因型患者較T等位基因攜帶者存在更加嚴(yán)重的焦慮癥狀。
　　結(jié)論:5-HT3A TT基因型和5-HT3E GA基因型可能是非絕經(jīng)期女性IBS-D患者腸道癥狀惡化的重要因素，而5-HT3A CC基因型則與患者焦慮癥狀密切相關(guān)。
　　3. MiR-510對野生型和突變型5-HT3E基因3'UTR作用的研究
　　目的:在第一第二部分發(fā)現(xiàn)5-HT3E基因的GA基因型與女性

9、IBS-D的的易感性和腸道癥狀嚴(yán)重度有關(guān)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究其機(jī)制。
　　方法:通過生物信息學(xué)預(yù)測及文獻(xiàn)資料，我們發(fā)現(xiàn)，5-HT3E基因的3'UTR SNPrs56109847位點(diǎn)被預(yù)測位于miRNA-510的結(jié)合識別區(qū)域，可能會影響miRNA-510與靶mRNA的結(jié)合。為了證明我們的假設(shè)，我們設(shè)計(jì)了雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)，通過檢測熒光素酶的表達(dá)來驗(yàn)證SNP是否影響基因表達(dá)。首先我們構(gòu)建了含有SNP的海腎熒光素酶重組質(zhì)粒（pRL-

10、TK-5-HT3E-3'UTR-c.*76A/G），然后與熒光素酶報(bào)告載體(pGL3-control)、miRNA-510質(zhì)粒或者陰性對照miRNA質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞（HEK293和HT-29），最后運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測熒光強(qiáng)度，驗(yàn)證miR-510是否與5-HT3E野生型3'UTR重組質(zhì)粒結(jié)合以及明確突變型(rs56109847G—A)是否影響miR-510與靶基因的結(jié)合。pRL-TK-5-HT3E-3'UTR-c.

11、*76A/G與pGL3-control共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測未有miR-510參與SNP是否影響基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:僅轉(zhuǎn)染pRL-TK-5-HT3E-3'UTR-c.*76A/G及pGL3-control時(shí)，c.*76G組相對熒光素酶表達(dá)水平與c.*76A組及空白對照組相比HEK293和HT-29兩個(gè)細(xì)胞系均無顯著性差異。而將c.*76G與pGL3-control及miR-510質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí)相對熒光素酶表達(dá)水平與c.*76A組相比兩

12、個(gè)細(xì)胞系均顯著降低。但兩種重組質(zhì)粒與negtive controls質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí)相對熒光素酶表達(dá)水平均無顯著性差異。
　　結(jié)論:5-HT3E rs56109847位點(diǎn)G等位基因能夠與miR-510發(fā)生特異性結(jié)合，而突變型(rs56109847G—A)可能因?yàn)榘谢?'端突變逃逸了miR-510正常的調(diào)節(jié)作用。
　　4. IBS-D女性患者5-HT3E基因3'UTR多態(tài)性與腸粘膜5-HT3E表達(dá)的關(guān)聯(lián)研究
　　目的:探討

13、揚(yáng)州地區(qū)IBS-D女性患者與正常對照結(jié)腸粘膜5-HT3E蛋白表達(dá)的異同以及IBS-D女性患者5-HT3E rs56109847基因多態(tài)性與結(jié)腸粘膜5-HT3E蛋白含量之間的關(guān)聯(lián)。
　　方法:采用PCR-RFLP方法對53例IBS-D女性患者5-HT3E rs56109847進(jìn)行基因分型;采用免疫組化和Western blot技術(shù)對IBS-D患者和健康對照者結(jié)腸粘膜5-HT3E的表達(dá)進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果:5-HT3E大量表達(dá)于

14、結(jié)腸粘膜腺體周圍，少量表達(dá)于間質(zhì)中;IBS-D患者結(jié)腸粘膜組織中5-HT3E的蛋白表達(dá)高于正常組織;GA雜合子患者結(jié)腸粘膜5-HT3E的蛋白表達(dá)高于GG純合子。
　　結(jié)論:5-HT3E在女性IBS-D的發(fā)生過程中可能發(fā)揮了重要的促進(jìn)作用;SNP rs56109847與5-HT3E的蛋白表達(dá)相關(guān)。
　　5. IBS-D重疊PMS患者中醫(yī)證型及心身狀況研究
　　目的:探討IBS-D重疊經(jīng)前期綜合征(PMS)患者中醫(yī)證型及婦

15、科經(jīng)歷、腸道癥狀、心理癥狀的特點(diǎn)。
　　方法:參考包含羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)和SCL-90量表的前期國外研究，采用問卷調(diào)查的方式對113例重疊患者和102例IBS-D患者進(jìn)行研究:(a)了解重疊患者中醫(yī)證型與心理癥狀的關(guān)聯(lián);(b)比較重疊組與IBS-D組心理癥狀的異同;(c)比較兩組間婦科經(jīng)歷的異同;(d)比較兩組間排便特點(diǎn)和排便習(xí)慣的異同。
　　結(jié)果:重疊患者四種中醫(yī)證型中，肝相關(guān)證型較非肝相關(guān)證型在焦慮、抑郁上有顯著差異;絕大多數(shù)重

16、疊患者都報(bào)告有剖宮產(chǎn)史、反復(fù)流產(chǎn)史以及PMS歷史;與IBS-D組相比，重疊組中絕大多數(shù)都有嚴(yán)重痛經(jīng)和較長的月經(jīng)期;與IBS-D組相比，重疊組有更加嚴(yán)重的腸道癥狀和焦慮癥狀。
　　結(jié)論:重疊癥肝相關(guān)證型較非肝相關(guān)證型存在更加嚴(yán)重的焦慮和抑郁癥狀;重疊患者與單純IBS-D患者在婦科經(jīng)歷、腸道癥狀的嚴(yán)重度和焦慮癥狀上存在顯著差異。
　　綜上所述，我國揚(yáng)州地區(qū)漢族人群IBS-D的發(fā)生、流行以及腸道癥狀的嚴(yán)重度可能與5-HT3A基因5