維生素對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠血清瘦素和其他細(xì)胞因子的影響及作用機(jī)制.pdf

1、研究背景及目的:
　　 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，以非化膿性增生性滑膜炎為特點(diǎn)，逐漸導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞，最后造成關(guān)節(jié)功能的障礙。RA是全世界范圍內(nèi)倍受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，流行病學(xué)調(diào)查顯示我國(guó)患病率約為0.32～0.36％，歐洲成年人RA患病率為0.2％～0.8％，其中南歐地區(qū)(意大利、希臘）患病率較低，為0.2％～0.4％，患病率隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸增加，研究顯示老年人(

2、65歲以上或70歲以上)患病率最高，其中女性高于男性。RA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、營(yíng)養(yǎng)、感染等多個(gè)因素。大量研究表明，細(xì)胞因子的異常產(chǎn)生和相互作用在形成RA炎癥、黏附、新生血管形成和骨質(zhì)減少方而起著重要的作用。細(xì)胞因子是活化的免疫細(xì)胞和某些基質(zhì)細(xì)胞分泌的具有生物活性的小分子多肽物質(zhì)的總稱，它包括淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子和單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的單核因子，作為細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，主要調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與免疫細(xì)胞分化發(fā)育、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、刺激造血功能并

3、參與組織修復(fù)等。RA的啟動(dòng)是通過(guò)遞呈至今未明的抗原或自身抗原給CD4+淋巴細(xì)胞，兩者相互作用激活了淋巴細(xì)胞，而活化的淋巴細(xì)胞可以刺激單核/巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子能介導(dǎo)RA炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)損傷。RA中存在復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)的生物學(xué)效應(yīng)則依靠于細(xì)胞因子及其抑制物的相對(duì)濃度。
　　 瘦素(leptin)主要是由白色脂肪組織分泌的一種非糖基化蛋白類激素，分子量為16000，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為leptin主要與脂肪儲(chǔ)存、能量攝入

4、以及機(jī)體對(duì)食物的攝入有關(guān)。越來(lái)越多的證據(jù)顯示瘦素是機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀況和免疫系統(tǒng)之間相互影響、相互聯(lián)系的重要中介，與自身免疫性疾病有密切關(guān)系，可作為炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中的一種細(xì)胞因子發(fā)揮作用。leptin主要通過(guò)JAK/STAT信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、免疫調(diào)節(jié)、炎癥等多種過(guò)程中發(fā)揮重要作用，瘦素受體屬于Ⅰ類細(xì)胞因子超家族，包括細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。作為JAK家族的成員，胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)合于瘦素受體上，其識(shí)別位點(diǎn)分布于受體特異的

5、膜近端區(qū)域，STATs與細(xì)胞膜上的瘦素受體特異性結(jié)合，酪氨酸被JAKs磷酸化后，STATs與受體解離，形成同型或異型二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)特異的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成。由于該通路中的STATs是一組多效能蛋白質(zhì)，在不同條件下可表現(xiàn)出不同的生物學(xué)功效。在RA中，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要是STAT1和STAT3。
　　 紅細(xì)胞沉降率(Erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C反應(yīng)蛋白(C-reactivepr

6、otein，CRP)、類風(fēng)濕因子(Rheumatoid arthritis，RF)是RA常用的輔助診斷項(xiàng)目。ESR增快表明機(jī)體處于病理狀態(tài)，廣泛用于監(jiān)測(cè)感染、炎癥及一些癌癥患者的疾病活動(dòng)程度;CRP是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，很多急性和慢性炎性反應(yīng)時(shí)CRP均表現(xiàn)為增高;RF是目前最常用的血清學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目，RF的敏感性雖高，特異性卻不高，在RA以外的其他疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性干燥綜合征、惡性腫瘤甚至一些正常的老年人也可出現(xiàn)升高，經(jīng)常容易造

7、成誤診和漏診，給早期診斷帶來(lái)困難，從而延誤病情，錯(cuò)過(guò)治療時(shí)機(jī)，因此RF陽(yáng)性不能作為診斷RA唯一標(biāo)準(zhǔn)。近年的研究表明，RF與臨床表現(xiàn)和關(guān)節(jié)損傷程度密切相關(guān)，是損傷指標(biāo)中最強(qiáng)有力的預(yù)后因子之一，但不是RA的高特異性血清標(biāo)志物，其他指標(biāo)如CRP、ESR等也不能取代RF在RA診斷和預(yù)后判斷中的地位。
　　 對(duì)RA的治療目前尚缺乏特效手段，主要采用改善病情的抗風(fēng)濕藥物、非甾體類抗炎藥、生物制劑等，由于用藥周期長(zhǎng)加上藥物的一些副反應(yīng)，病人依

8、從性較差。一項(xiàng)調(diào)查顯示有20％～50％的患者希望通過(guò)膳食減輕RA癥狀，約有2/3的RA患者使用過(guò)膳食補(bǔ)充劑。盡管RA的病因尚不明確，大量研究表明，富含魚類、橄欖油、蔬菜的飲食能抑制RA病情的發(fā)展，而富含紅肉等的食物能加重病情。研究表明，具有抗氧化功能的維生素可能對(duì)RA具有治療作用，VitA、VitE具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種生物功能。體外實(shí)驗(yàn)顯示VitA、VitE具有抑制某些炎癥因子的作用。
　　 本研究擬通過(guò)建立類風(fēng)濕

9、關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察瘦素在RA發(fā)病過(guò)程中所起的作用;灌胃給予類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠VitA、VitE，取血清及滑膜組織，觀察VitA、VitE對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠血清細(xì)胞因子如瘦素、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10水平的影響，同時(shí)觀察其對(duì)疾病活動(dòng)指標(biāo)ESR、CRP、RF的影響。采用Western blot研究VitA、VitE對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織STAT1、STAT3蛋白表達(dá)水平的影響，從分子水平探討VitA、VitE在RA中所起

10、的作用。
　　 材料與方法:
　　 選體重為（147±15g）的健康雄性Wistar大鼠作為研究對(duì)象，飼養(yǎng)于恒溫，恒濕條件下并自由攝取食水，飼養(yǎng)一周左右開始實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為正常組和模型組。將牛Ⅱ型膠原與弗氏不完全佐劑用三通管在低溫條件(＜3℃)下按1∶1的比例充分乳化（約1h），形成乳白色粘稠樣液體備用。用5％水合氯醛5ml/kg常規(guī)腹腔麻醉，將配置好的試劑按3點(diǎn)/只，0.05ml/點(diǎn)皮內(nèi)注射進(jìn)行初次免疫，以皮膚出現(xiàn)白色丘

11、疹樣隆起為度。初次免疫動(dòng)物2周后，加強(qiáng)免疫一次，劑量:2點(diǎn)/只，0.05ml/點(diǎn)，空白對(duì)照組用生理鹽水0.2ml腹腔注射。初次免疫第一天起，每天觀察大鼠的生長(zhǎng)情況，重點(diǎn)觀察四肢足關(guān)節(jié)腫脹情況，并按0～4級(jí)進(jìn)行評(píng)分，四肢評(píng)分之和為關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis index，AI)，AI越高，表明關(guān)節(jié)炎程度越嚴(yán)重。0分，無(wú)關(guān)節(jié)炎;1分，關(guān)節(jié)表面有紅色斑點(diǎn)或關(guān)節(jié)部位輕度腫脹;2分，關(guān)節(jié)部位中度腫脹;3分，關(guān)節(jié)部位嚴(yán)重腫脹;4分，關(guān)節(jié)部位嚴(yán)重腫

12、脹，且不能負(fù)重。四周后將模型制作組中AI≥6的大鼠保留。
　　 模型組大鼠于第4周末隨機(jī)分為4組，即模型組;模型組+VitA42.86μgRE/kg.bw;模型組+VitE200mg/kg.bw;模型組+布洛芬50mg/kg.bw。藥物均為灌胃給藥，正常對(duì)照組予等體積生理鹽水腹腔注射，每日一次，持續(xù)4周。4周后，小鼠禁食24h，6％水合氯醛麻醉后，腹主動(dòng)脈取血處死，分離血清，置-20℃保存。打開膝關(guān)節(jié)腔，完整剝離滑膜組織。用EL

13、ISA法按試劑盒操作，檢測(cè)血清瘦素、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10水平，以Western blot印跡分析STAT1、STAT3蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.CIA大鼠模型的建立
　　 牛Ⅱ型膠原與弗氏不完全佐劑建立CIA大鼠模型，以關(guān)節(jié)炎指數(shù)為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，AI≥6的大鼠保留。模型組與空白對(duì)照組同期比較，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅腫，累及踝關(guān)節(jié)、趾間關(guān)節(jié)及膝關(guān)節(jié)，此可以得出結(jié)論，CIA大鼠模型建立成功。

14、
　　 2.CIA大鼠血清leptin、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10及ESR、CRP、RF的水平。
　　 模型組大鼠血清leptin、TNF-α、IL-6水平明顯高于對(duì)照組(P=0.000); IL-4、IL-10水平低于對(duì)照組，差異有顯著性(P=0.000，0.001);模型組大鼠血清ESR、CRP、RF高于對(duì)照組，差異有顯著性(P=0.000）;
　　 3.VitA、ViE對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)

15、、細(xì)胞因子、疾病活動(dòng)指標(biāo)的影響。
　　 與模型組相比，VitA組與VitE組關(guān)節(jié)炎指數(shù)降低，差異有顯著性(P=0.008，0.014);與模型組相比，VitA組leptin、TNF-α、IL-6水平降低，差異有顯著性（P=0.000，0.038，0.000），VitE組leptin、TNF-α、IL-6水平亦降低，差異有顯著性(P=0.004，0.033，0.000); VitA、VitE組與模型組比，IL-10含量升高，差異有

16、顯著性（P=0.006，0.001）。VitA組與模犁組比，ESR、CRP含量明顯降低，差異有顯著性（P=0.025，0.001），VitE組與模型組比， ESR、CRP含量亦明顯降低，差異有顯著性(P=0.001，0.017)
　　 4.VitA、VitE對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織p-STAT1、p-STAT3表達(dá)水平的影響
　　 與對(duì)照組相比，模型組p-STAT1、p-STAT3蛋白表達(dá)水平升高，差異有顯著性(P=0.

17、000)。VitA、VitE給藥4周后，p-STAT3蛋白表達(dá)水平較模型組降低，差異有顯著性(P=0.000）。
　　 結(jié)論:
　　 1.應(yīng)用牛Ⅱ型膠原加弗氏不完全佐劑建立方法可以成功制作大鼠RA模型，該模型是國(guó)內(nèi)外最常用的RA動(dòng)物模型。
　　 2.在RA發(fā)病過(guò)程中存在一個(gè)失衡的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，促炎性細(xì)胞因子相對(duì)增多，抑炎性細(xì)胞因子相對(duì)減少，leptin參與了RA的發(fā)病過(guò)程，可作為一種促炎性細(xì)胞因子發(fā)揮作用。