青藤堿對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎樹突狀細(xì)胞趨化因子及受體的影響和機(jī)制.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種累及全身多個組織和臟器的慢性、炎癥性疾病。主要病理過程是滑膜受累導(dǎo)致滑膜炎癥，引起骨和軟骨的損傷，最后發(fā)展為關(guān)節(jié)畸形和關(guān)節(jié)強(qiáng)直。RA也可以產(chǎn)生全身性彌漫性炎癥，包括肺間質(zhì)的改變、心包、胸膜、鞏膜的受累，以及常見的皮下組織的皮膚結(jié)節(jié)。雖然RA的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但自身免疫在RA發(fā)病機(jī)制、發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮的關(guān)鍵作用已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可。RA在全世界的發(fā)病率約為1%，女性與男性的比例為3：1。所有年齡均可發(fā)病，最常

2、見的發(fā)病年齡40歲到50歲。RA是主要的致殘性疾病之一，造成關(guān)節(jié)活動功能的喪失，給社會和家庭帶來巨大的壓力和負(fù)擔(dān)。 在RA的發(fā)病機(jī)制中，在免疫基因易感宿主的自身抗原誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用。T細(xì)胞活化后導(dǎo)致多種免疫效應(yīng)，包括滑膜細(xì)胞的增殖，內(nèi)皮細(xì)胞的活化。骨髓和外周血中前炎癥細(xì)胞活化，巨噬細(xì)胞、成纖維樣滑膜細(xì)胞、B細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子和自身抗體。樹突狀細(xì)胞（DC）是體內(nèi)功能最為強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，是唯一可以激活初始T細(xì)

3、胞的抗原提呈細(xì)胞。DC起源于骨髓干細(xì)胞，平時寄居在組織和外周血中。外周組織中的DC識別抗原后在細(xì)胞因子的刺激下逐漸分化，高表達(dá)MHC分子和協(xié)同刺激分子，在向次級淋巴器官遷移的過程中逐漸成熟，而后在淋巴器官中與T細(xì)胞結(jié)合，刺激其活化或誘導(dǎo)其耐受。研究表明，RA患者滑膜和關(guān)節(jié)中浸潤的T細(xì)胞周圍可見成熟的DC。這些DC高表達(dá)MHC Ⅱ類分子和CD40、CD80、CD86以及DC-SIGN等粘附分子和趨化因子受體，對T細(xì)胞的活化和組織的損傷起著

4、重要作用。 RA屬祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)痹證范疇。痹證的分類，按病因可分為風(fēng)痹、寒痹、濕痹、熱痹、風(fēng)濕熱痹等；從病理特點(diǎn)可分為行痹、痛痹、著痹。痹證的發(fā)生主要是由于正氣不足，感受風(fēng)、寒、濕、熱之邪所致。內(nèi)因是基礎(chǔ)，素體虛弱、正氣不足、腠理不密、衛(wèi)外不固，是引起痹證的內(nèi)在因素，如再感受外邪，使肌肉、關(guān)節(jié)、經(jīng)絡(luò)痹阻而形成痹證。痹證的治療以祛風(fēng)通絡(luò)為基本大法，首先應(yīng)辨明寒熱，治以祛風(fēng)、除濕、舒筋活絡(luò)，隨其寒熱而兼行清熱或祛寒。對于病程日久，氣血

5、損傷，臟腑虧虛的痹證患者，應(yīng)配合運(yùn)用補(bǔ)益之法。 青藤堿是中藥清風(fēng)藤的單體提取物，用于治療RA已經(jīng)有2000年的歷史。研究發(fā)現(xiàn)青藤堿有抗炎、抗風(fēng)濕的藥理作用。盡管青藤堿廣泛的藥理作用已經(jīng)得到闡明，但其作用機(jī)制，尤其是免疫抑制的機(jī)理尚有待進(jìn)一步研究。為了進(jìn)一步闡明青藤堿的藥理作用，探討其免疫抑制和RA的機(jī)理，本課題觀察了青藤堿對RA患者DC趨化因子及其受體表達(dá)的影響和機(jī)制。 目的： 1.觀察RA患者DC表面趨化因子受

6、體的表達(dá)，研究DC表面趨化因子受體與RA患者疾病活動的相關(guān)關(guān)系。 2.建立DC趨化因子及其受體的熒光定量PCR檢測體系。 3.觀察青藤堿對RA患者DC趨化因子及其受體表達(dá)的影響。 4.觀察青藤堿對RA患者DC泛素和E3連接酶表達(dá)的影響。 5.揭示青藤堿免疫抑制的機(jī)理，為青藤堿治療RA提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.人外周血DC體外培養(yǎng)體系的建立。 根據(jù)課題組已經(jīng)建立的方法，分離人

7、外周血單核細(xì)胞，RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用GM-CSF和IL-4聯(lián)合刺激，于培養(yǎng)第8天收獲。 2.DC表面趨化因子受體與RA患者疾病活動性的關(guān)系。 選取28名RA患者和10名正常健康人分為四組：正常組、低活動組、中活動組和高活動組。采用流式細(xì)胞儀檢測RA患者DC表面CCR5和CCR7的表達(dá)，收集患者類風(fēng)濕因子（RF）、C反應(yīng)蛋白（CRP）和抗CCP抗體。采用直線相關(guān)分析CCR5、CCR7和RA患者疾病活動指標(biāo)

8、的相關(guān)關(guān)系。 3.青藤堿對RA患者外周血DC趨化因子及其受體表達(dá)的影響。 采用1mM，2mM，5mM青藤堿溶液和空白對照溶液干預(yù)DC 12h。收集干預(yù)后的細(xì)胞提取DC總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增CCR5、CCR7、CXCL9、CXCL10、CXCL11和GAPDH cDNA片段，回收并純化PCR產(chǎn)物。將CCR5、CCR7、CXCL9、CXCL10、CXCL11和GAPDH的PCR產(chǎn)物分別按108，107，106

9、，105，104copies/μl梯度倍比稀釋，熒光定量PCR儀檢測并自動計(jì)算出樣品的定量結(jié)果，描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。將各樣本cDNA按照建立體系中的反應(yīng)條件在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，由電腦自動分析并計(jì)算出反應(yīng)體系中待測樣品cDNA達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)（Ct值）。以公式2-△△t計(jì)算出相對于空白對照組的青藤堿干預(yù)各組的DC中CCR5、CCR7、CXCL9、 CXCL10、CXCL11和GAPDH mRNA的表達(dá)水平。收集DC培養(yǎng)上清，檢測

10、經(jīng)不同濃度青藤堿干預(yù)后DC培養(yǎng)上清中CXCL9、 CXCL10、CXCL11的表達(dá)。 4.青藤堿對RA患者外周血DC中泛素和E3表達(dá)的影響。 收集青藤堿干預(yù)后的RA患者外周血DC，提取DC總RNA和蛋白。Real time PCR檢測DC中泛素和E3連接酶mRNA的表達(dá)，western-blotting檢測青藤堿對RA患者DC中泛素和E3連接酶表達(dá)的影響。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件

11、進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以X±S表示，多組間均數(shù)比較采用One way-ANOVA，多個組分別與對照組比較采用Dunnett檢驗(yàn)；連續(xù)變量間的直線相關(guān)采用Pearson相關(guān)分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.在GM-CSF和IL-4聯(lián)合刺激的作用下，單核細(xì)胞成功的分化為DC。在光鏡和電鏡下觀察可見其呈現(xiàn)典型的樹突狀形態(tài)，與對照組相比，RA低、中、高活動組患者CCR5（F=107.53，P=0.000）和CCR7（F

12、=46.283，P=0.000）表達(dá)較高。 2.在低疾病活動組（RF，r=0.775，P=0.014； CRP，r=0.802，P=0.009）、中疾病活動組（RF，r=0.0854，P=0.002；CRP，r=0.818，P=0.004）、高疾病活動組（RF，r=0.773，P=0.015；CRP，r=0.699，P=0.036）表達(dá)在RA患者DC表面CCR5與RF和CRP存在直線相關(guān)關(guān)系，相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CCR5相似，

13、在低疾病活動組（RF，r=0.754，P=0.019； CRP，r=0.968，P=0.000）、中疾病活動組（RF，r=0.0854，P=0.002；CRP，r=0.949，P=0.000）、高疾病活動組（RF，r=0.938，P=0.000； CRP，r=0.968，P=0.000）表達(dá)在RA患者DC表面CCR7與RF和CRP存在直線相關(guān)關(guān)系，相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.流式細(xì)胞結(jié)果顯示，青藤堿干預(yù)后DC表面CCR5（F=89

14、.236，P=0.000）和CCR7（F=94.731，P=0.000）表達(dá)有顯著差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與空白對照組相比，2mM、5mM sinomenine干預(yù)后DC表面CCR5和CCR7（P<0.05 or P<0.01）表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；GAPDH、CCR5、CCR7、CXCL9、CXCL10、CXCL11陽性梯度定量模板數(shù)與Ct值關(guān)系對數(shù)擬合作圖，得到不同梯度定量模板的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)（Ct值）之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，

15、分別有著非常好的相關(guān)關(guān)系（0.9943、0.9955、0.9926、0.9981、0.9938、0.9994）。熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與空白對照相比，經(jīng)2mM和5mM青藤堿干預(yù)后的DC中CCR5、CCR7、CXCL9、CXCL10、CXCL11 mRNA表達(dá)均有所有降低（P<0.05 or P<0.01）；ELISA結(jié)果顯示，與空白對照相比，經(jīng)青藤堿干預(yù)后的DC培養(yǎng)上清中CXCL9、CXCL10、CXCL11差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

16、 4.熒光定量PCR結(jié)果顯示，青藤堿4個劑量組之間RA患者外周血DC中泛素（F=41.222，P=0.000）、E3連接酶（F=59.657，P=0.000）mRNA表達(dá)有顯著性差異；與空白對照組相比，經(jīng)2mM和5mM青藤堿干預(yù)后DC中泛素和E3連接酶表達(dá)顯著降低；Western-blot檢測結(jié)果顯示，經(jīng)青藤堿干預(yù)后4組泛素和E3連接酶的表達(dá)均有所改變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.建立了RA患者外周血樹突狀細(xì)胞趨

17、化因子受體檢測體系。 2.不同疾病活動情況下RA患者DC表面趨化因子受體的表達(dá)與RA患者疾病活動指標(biāo)存在直線相關(guān)關(guān)系，DC表面CCR5和CCR7可能是監(jiān)測RA患者疾病活動和治療效果的有效指標(biāo)。 3.青藤堿可有效抑制RA患者DC趨化因子及其受體的表達(dá)，青藤堿的免疫抑制機(jī)理可能與抑制DC的遷移有關(guān)，青藤堿可能通過抑制DC遷移到次級淋巴器官與T細(xì)胞結(jié)合，從而達(dá)到治療RA的作用。 4.青藤堿可能抑制泛素-蛋白酶體中重要蛋