VIP及Bay11-7082誘導(dǎo)耐受性樹突狀細(xì)胞治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效和作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制涉及抗原遞呈細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、滑膜成纖維細(xì)胞及細(xì)胞因子，在疾病發(fā)展過程中滑膜增殖形成血管翳，造成軟骨和骨的侵蝕破壞，最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形、功能喪失和不同程度的殘廢。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是公認(rèn)的功能最強(qiáng)大的專職性抗原提呈細(xì)胞，在誘導(dǎo)免疫反應(yīng)及免疫耐受形成中起重要作用。耐受性DC(

2、tolerogenic dendriticcells，tDCs)具有誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受從而抑制自身免疫反應(yīng)的作用;誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)增殖和分化;分泌高劑量的IL-4、IL-10，一方面可以使Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-α，從而抑制炎癥反應(yīng)，另一方面，高劑量IL-10也減少DC表面MHC-Ⅱ分子、共刺激分子和黏附分子表達(dá)，不能為T細(xì)胞提供相應(yīng)的刺激信號(hào)。目前僅有一些初步研究探討了tDC在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用，而如何獲得安全有效的耐受性DC

3、成為研究的關(guān)鍵。血管活性腸肽(VIP)是潛在的免疫抑制劑，可以影響固有免疫和獲得性免疫，VIP治療膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎，能減少致炎因子產(chǎn)生，增加抑炎因子水平，減輕關(guān)節(jié)炎癥和骨侵蝕。VIP作用機(jī)理是通過與巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞表面的受體(VPAC1)結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞鈍化，而VPAC1是樹突狀細(xì)胞的主要功能受體，因此有研究采用VIP誘導(dǎo)培養(yǎng)tDC，發(fā)現(xiàn)VIP誘導(dǎo)培養(yǎng)的人類耐受性DCs可上調(diào)CD4及CD8調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞），而后者可通過下調(diào)T

4、h1細(xì)胞的活性和歸巢來緩解炎癥性疾病的病程，證實(shí)了VIP-tDCs的免疫耐受作用。tDC要作為治療細(xì)胞回輸體內(nèi)，必須保證低或無免疫原性，然而，Heusch等研究發(fā)現(xiàn)作為治療性tDC一旦進(jìn)入宿主體內(nèi)可能會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫源性而非免疫耐受，因而獲得低免疫源性的tDCs成為tDC治療的另一關(guān)鍵，如采用低劑量GM-CSF培養(yǎng)液、加入抑炎因子如IL-4、IL-10等方法。而更直接獲得tDCs的方法則是通過抑制DC成熟過程中的信號(hào)傳導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn)，其中核

5、因子κB（NFκB）是參與其成熟的重要的核轉(zhuǎn)錄因子，Zanetti等在體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)了NFκB在DCs成熟中的重要性，從敲除NFκB的RelB基因大鼠獲得的tDCs免疫大鼠，結(jié)果顯示其抗原特異性呈低反應(yīng)性，說明了通過阻斷NFκB途徑獲得tDC的可行性，并可有效降低其免疫原性反應(yīng)。此外，Popov等報(bào)道應(yīng)用NF-κB拮抗劑(LF15-0195)誘導(dǎo)培養(yǎng)耐受性DCs，不僅成功獲得了具有未成熟DCs細(xì)胞表型的tDCs，免疫實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎大鼠也觀察

6、了初步的臨床緩解，并抑制了抗原特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。因此，通過干預(yù)DCs成熟過程中的不同環(huán)節(jié)及改變不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，可能獲得具有低免疫原性并能誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受的tDCs，并應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的干預(yù)治療，從而為進(jìn)一步揭示RA發(fā)病機(jī)制，尋找免疫干預(yù)的不同位點(diǎn)和方法具有重要的意義。
　　目的：用不同方法誘導(dǎo)培養(yǎng)tDCs，尋找合適的作為耐受性DC培養(yǎng)條件，同時(shí)將VIP誘導(dǎo)培養(yǎng)的具有高效免疫耐受活性的tDC與阻斷NFκB途徑獲

7、得的非成熟DC的低免疫源性相比較，從而獲得具有免疫調(diào)節(jié)作用的高效耐受性DCs，鑒定其細(xì)胞表型、分泌的細(xì)胞因子，用獲得的耐受性DC干預(yù)膠原誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠，評(píng)估治療效果，并探討tDC可能的作用機(jī)制。
　　方法：⑴探索合適的VIP、Bay11-7082誘導(dǎo)耐受性樹突狀細(xì)胞(tDCs)的體系，并鑒定誘導(dǎo)的耐受性樹突狀細(xì)胞表面分子標(biāo)志、及其所分泌的細(xì)胞因子；⑵驗(yàn)證不同誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)的耐受性DCs進(jìn)行免疫干預(yù)治療膠原誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)

8、炎的可行性與有效性；⑶探討耐受性樹突狀細(xì)胞治療膠原誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎可能的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：①提取DBA/1小鼠骨髓細(xì)胞，分別給予GM-CSF、IL-4、不同濃度VIP、Bay進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-4濃度。結(jié)果:不同濃度VIP、Bay刺激均能使樹突狀細(xì)胞表面分子標(biāo)志MHCⅡ、CD40、CD80、CD86表達(dá)下調(diào)，與空白組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而樹突狀

9、細(xì)胞特異性表面標(biāo)志CD11c在各組間表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。VIP濃度不同，細(xì)胞成熟表面分子標(biāo)志表達(dá)下調(diào)程度不同，但各組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中以VIP40ng/ml組下調(diào)最明顯。Bay濃度不同，細(xì)胞成熟表面標(biāo)志表達(dá)降低程度也不同，其中Bay0.5μg/ml組MHCⅡ及CD80降低程度大于0.1μg/ml組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？瞻譊C組、VIP組、Bay組培養(yǎng)上清液中，TNF-α及IL-1β水平在各組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而IFN-γ水平在VI

10、P-DC及Bay-DC組均較空白DC組降低(P＜0.05)，而IL-4水平則較空白DC組明顯升高(P＜0.05)。VIP40ng/ml及Bay0.5μg/ml是最適合的培養(yǎng)條件。②采用牛Ⅱ型膠原乳劑足部注射誘導(dǎo)DBA/1小鼠實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎造模成功后，隨機(jī)分為4組:未發(fā)病組、發(fā)病未治療組、空白DC組、VIP-DC組、Bay-DC組，分別給予生理鹽水、空白DC、VIP-DC及Bay-DC腹腔注射免疫小鼠，采用關(guān)節(jié)炎評(píng)

11、分指數(shù)、microMRI和病理檢測(cè)滑膜炎程度及骨侵蝕情況評(píng)估療效。結(jié)果:VIP-DC及BAY-DC治療組關(guān)節(jié)炎積分下降趨勢(shì)較對(duì)照及空白DC組明顯，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;足趾和踝關(guān)節(jié)microMRI檢測(cè)， VIP-DC組及Bay-DC組CIA小鼠關(guān)節(jié)滑膜增厚程度及腫脹程度均較發(fā)病未治療組及空白DC組有所減輕;受累關(guān)節(jié)病理學(xué)檢查顯示:發(fā)病未治療組和空白DC治療組，滑膜細(xì)胞明顯增厚，細(xì)胞層數(shù)平均增加1倍，VIP-DC和Bay-DC治療后滑膜細(xì)胞增厚

12、有好轉(zhuǎn)，但仍厚于正常關(guān)節(jié)，各組間雖有變化趨勢(shì)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)沒有差異。炎癥細(xì)胞浸潤評(píng)分、炎癥評(píng)分有類似變化。血管翳與骨侵蝕明顯相關(guān)，發(fā)病未治療和空白DC組血管翳增生明顯，VIP-DC治療后血管翳消失，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.005)，Bay-DC治療后血管翳有好轉(zhuǎn)，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。VIP-DC及Bay-DC組均較發(fā)病未治療組及空白DC組具有較少的骨侵蝕(P=0.002，P=0.026)。與未發(fā)病組比較，其他各組滑膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞浸潤、血

13、管翳、炎癥及骨侵蝕評(píng)分增加，P＜0.05，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。VIP-DC組與Bay-DC組比較，血管翳評(píng)分減少，P＜0.05。③采用ELISA法檢測(cè)模型鼠血清抗Ⅱ型膠原抗體及致炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β及抑炎因子IL-4濃度。結(jié)果:抗Ⅱ型膠原抗體發(fā)病未治療組明顯高于未發(fā)病組，空白DC組、VIP-DC組、Bay-DC有下降趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與未發(fā)病組比，發(fā)病未治療組TNF-α明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)意義，IF

14、N-γ、IL-1β有升高趨勢(shì)，IL-4濃度有降低趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)意義(P＞0.05)。與發(fā)病未治療組比，VIP-DC治療后TNF-α，IL-1β濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)，Bay-DC治療后IFN-γ、IL-1β明顯降低，IL-4明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：⑴VIP、Bay誘導(dǎo)的耐受性樹突狀細(xì)胞具有低表達(dá)MHCⅡ、CD40、CD80、CD86分子，高表達(dá)CD11c特性，并高水平分泌IL-4，