迷迭香酸對CUS大鼠抑郁樣行為的改善作用及其機制研究.pdf

1、研究目的：
　　本研究的主要目的是應(yīng)用慢性不可預(yù)見應(yīng)激（chronic unpredictable stress，CUS）的大鼠模型進行研究，探討迷迭香酸（Rosmarinic acid，RA）對CUS大鼠抑郁樣行為的改善作用以及對大鼠海馬區(qū)域細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular-regulated kinase，ERK）信號傳遞的改變，海馬的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic fa

2、ctor，BDNF）、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）水平的調(diào)節(jié)是否是RA改善CUS模型大鼠抑郁樣行為的基礎(chǔ)。此外，本研究還通過離體研究觀察了RA對海馬星形膠質(zhì)細胞活力、增殖的作用以及對其ERK1/2磷酸化水平和BDNF、GDNF表達的影響，以進一步探討RA發(fā)揮抗抑郁作用的細胞學基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　1、觀察RA干預(yù)對CUS抑郁模型

3、大鼠的抑郁樣行為及海馬ERK1/2磷酸化水平和BDNF、GDNF表達的影響。
　　雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠被隨機分為6組，每組16只：（1）對照組（sham+ vehicle），實驗大鼠常規(guī)飼養(yǎng)2周后，每天腹腔注射生理鹽水，連續(xù)2周；（2）對照+RA低劑量組（sham+RA(L)），實驗大鼠常規(guī)飼養(yǎng)2周后，每天腹腔注射RA（5 mg/Kg體重），連續(xù)2周；（3）對照+RA高劑量組（sham+RA(H)），實驗大

4、鼠常規(guī)飼養(yǎng)2周后，每天腹腔注射RA（10 mg/Kg體重），連續(xù)2周；（4）模型組（CUS+vehicle），大鼠接受為期3周的慢性不可預(yù)見應(yīng)激，從第3周干預(yù)開始，每天腹腔注射生理鹽水，連續(xù)2周；（5）模型+RA低劑量組（CUS+RA(L)），大鼠接受為期3周的慢性不可預(yù)見應(yīng)激，從第3周干預(yù)開始，每天腹腔注射RA（5 mg/Kg體重），連續(xù)2周；（6）模型+RA高劑量組（CUS+RA(H)），大鼠接受為期3周的慢性不可預(yù)見應(yīng)激，從第3周

5、干預(yù)開始，每天腹腔注射RA（10 mg/Kg體重），連續(xù)2周。RA干預(yù)結(jié)束后，對實驗設(shè)計中的部分大鼠（每組8只，共計48只）進行強迫游泳實驗和曠場實驗、測試后，提取大鼠的海馬組織蛋白樣品，分別檢測 BDNF、GDNF、ERK1/2、pERK1/2的水平。其余8只大鼠進行水迷宮實驗。
　　2、應(yīng)用ERK磷酸化抑制劑U0126干預(yù)后，觀察RA干預(yù)對CUS抑郁模型大鼠的抑郁樣行為及海馬ERK1/2磷酸化水平和BDNF表達的作用。

6、　　結(jié)合第一部分實驗的結(jié)果，實驗二仍然分為6組，每組16只：（1）對照組（sham+ vehicle），實驗大鼠常規(guī)飼養(yǎng)2周后，每天腹腔注射生理鹽水，連續(xù)2周，并且在注射生理鹽水前30 min注射對照溶劑（0.6 mL/Kg體重）；（2）對照+U0126組（sham+ U0126），實驗大鼠常規(guī)飼養(yǎng)2周后，每天腹腔注射生理鹽水，連續(xù)2周，并且在注射生理鹽水前30 min注射U0126（0.5 mg/Kg體重）；（3）模型組（CUS+ve

7、hicle），大鼠接受為期3周的慢性不可預(yù)見應(yīng)激，從第3周干預(yù)開始，每天腹腔注射生理鹽水，連續(xù)2周，并且在注射生理鹽水前30 min注射對照溶劑（0.6 mL/Kg體重）；（4）模型組+U0126組（CUS+U0126），大鼠接受為期3周的慢性不可預(yù)見應(yīng)激，從第3周干預(yù)開始，每天腹腔注射生理鹽水，連續(xù)2周，并且在注射生理鹽水前30 min注射U0126（0.5 mg/Kg體重）；（5）模型+RA高劑量組（CUS+RA(H)），大鼠接受為

8、期3周的慢性不可預(yù)見應(yīng)激，從第3周干預(yù)開始，每天腹腔注射RA（10 mg/Kg體重），連續(xù)2周，并且在注射生理鹽水前30 min注射對照溶劑（0.6 mL/Kg體重）；（6）模型+RA高劑量+U0126組（CUS+RA(H)+U0126），大鼠接受為期3周的慢性不可預(yù)見應(yīng)激，從第3周干預(yù)開始，每天腹腔注射RA（10 mg/Kg體重），連續(xù)2周，并且在注射生理鹽水前30 min注射U0126（0.5 mg/Kg體重）。對照溶劑為二甲基亞砜

9、（Dimethyl sulfoxide，DMSO）水溶液（DMSO：生理鹽水=1：4）。與第一部分實驗指標相同，干預(yù)結(jié)束后對部分大鼠（每組8只）進行強迫游泳和曠場實驗測試后，取其海馬組織蛋白樣品，分別檢測BDNF、ERK1/2、pERK1/2的水平。其余大鼠進行水迷宮實驗。
　　3、原代培養(yǎng)海馬星形膠質(zhì)細胞，觀察不同劑量 RA對該細胞活力、ERK1/2磷酸化水平和BDNF表達的影響。并在此基礎(chǔ)上添加U0126，觀察不同劑量RA對星

10、形膠質(zhì)細胞ERK1/2磷酸化水平和BDNF表達的影響。
　　通過原代培養(yǎng)的方法獲得新生SD大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞，經(jīng)純度鑒定后，接種于96或6孔細胞培養(yǎng)板中，待貼壁牢固后，加入不同濃度的RA（RA經(jīng)DMEM稀釋后，配置成10、50、100、200和400μg/mL的10×母液，在原培養(yǎng)體系中加入培養(yǎng)液1/10的母液即可達到終濃度，對照組加入相應(yīng)體積的DMEM），作用48 h后，通過WST-1方法檢測細胞活力，通過BrdU摻入實驗觀察

11、RA對星形膠質(zhì)細胞增殖的作用，同時取細胞上清液檢測BDNF釋放的情況，并且提取蛋白，用Western blot方法檢測ERK1/2，pERK1/2的表達情況。另一部分星形膠質(zhì)細胞在培養(yǎng)體系中加入U0126（終濃度2μM）,接種方式和檢測指標同前。
　　4、原代培養(yǎng)海馬星形膠質(zhì)細胞，觀察不同劑量RA對該細胞活力、增殖情況和GDNF表達的影響。
　　海馬星形膠質(zhì)細胞經(jīng)純度鑒定后，接種于96或24孔細胞培養(yǎng)板中，待貼壁牢固后，加入

12、不同濃度的RA（RA經(jīng)DMEM稀釋后，配置成10、50、100、200和400μg/mL的10×母液，在原培養(yǎng)體系中加入培養(yǎng)液1/10的母液即可達到終濃度，對照組加入相應(yīng)體積的DMEM），作用48 h或72 h后，取細胞上清液檢測GDNF釋放的情況。并且在作用72 h后，通過WST-1方法檢測細胞活力，通過BrdU摻入實驗觀察RA對星形膠質(zhì)細胞增殖的作用。
　　結(jié)果：
　　實驗一部分顯示，大鼠經(jīng)CUS處理后表現(xiàn)出明顯的抑郁樣

13、行為并且海馬磷酸化ERK1/2的表達和BDNF、GDNF的水平均下調(diào)；而經(jīng)RA干預(yù)后，抑郁模型大鼠的抑郁樣行為得到改善并且海馬磷酸化ERK1/2的表達和BDNF、GDNF的水平上調(diào)。具體如下：
　　1．與對照處理相比，CUS處理后大鼠：（1）在曠場實驗中，水平運動距離減少（P<0.01）；（2）強迫實驗中的大鼠不動時間延長（P<0.01）；（3）Morris水迷宮實驗中，在目標象限停留時間縮短（P<0.01）；（4）Western

14、 blot檢測結(jié)果顯示，海馬ERK1/2的表達沒有顯著影響，但是抑制了pERK1/2的表達（P<0.01）；（5）Elisa結(jié)果顯示，海馬BDNF、GDNF水平下降（均為P<0.01）。
　　2.與CUS組相比，經(jīng)高劑量RA（10 mg/Kg體重）治療后的大鼠：（1）在曠場實驗中，水平運動距離增加（P<0.05）；（2）強迫游泳不動時間縮短（P<0.05）；（3）水迷宮實驗中，在目標象限停留時間延長（P<0.05）；（4）West

15、ern blot檢測結(jié)果顯示，海馬ERK1/2的表達沒有顯著影響，但是pERK1/2的表達上調(diào)（P<0.05）；（5） Elisa結(jié)果顯示，海馬BDNF、GDNF水平上調(diào)（均P<0.05）。
　　實驗二部分，研究發(fā)現(xiàn)RA對抑郁動物行為的改善作用可以被U0126所阻斷，而且Western Blot的結(jié)果也顯示U0126不僅抑制了RA對抑郁動物海馬ERK1/2磷酸化的上調(diào)作用，而且抑制了其對BDNF的調(diào)節(jié)作用。具體如下：
　　1

16、.雙因素方差分析結(jié)果顯示，造模與否（sham vs. CUS）在曠場實驗的水平運動距離（F=27.088，P=0.000），強迫游泳不動時間（F=15.924，P=0.000）以及水迷宮實驗中，在目標象限停留時間（F=28.233，P=0.000）均存在顯著性差異。此外，各干預(yù)因素（包括對照溶劑、U0126、RA以及RA+U0126）之間對動物行為學的作用也存在顯著性差異，包括曠場實驗的水平運動距離（F=3.247，P=0.031），強

17、迫游泳不動時間（F=3.981，P=0.014）以及水迷宮實驗中，在目標象限停留時間（F=3.800，P=0.017）；而且處理方式和干預(yù)這兩種處理對上述三項行為學指標的影響不存在交互作用。進一步多重比較發(fā)現(xiàn)，RA高劑量組與RA高劑量+U0126在上述三項行為學檢測指標中均存在顯著性差異（P<0.05）。
　　2.實驗二也觀察了不同處理方式和干預(yù)因素對海馬pERK1/2和BDNF的水平的影響。其中，造模與否之間pERK1/2的表達

18、（F=30.712，P<0.001）和BNDF的水平（F=18.920，P=0.001）存在顯著差異；不同干預(yù)方式之間pERK1/2的表達（F=4.772，P=0.008）和BNDF的水平（F=2.646，P=0.041）也存在顯著差異。造模與否與不同干預(yù)方式之間不存在交互作用。多重比較結(jié)果顯示，RA高劑量組與RA高劑量+U0126在pERK1/2的表達和BNDF的水平中均存在顯著性差異（P<0.05）。
　　實驗三部分，通過原代

19、培養(yǎng)獲得星形膠質(zhì)細胞，在細胞培養(yǎng)基中加入不同劑量的RA作用48 h，結(jié)果顯示：直接給予不同劑量RA對星形膠質(zhì)細胞細胞活力（F5,30=0.456，P=0.806）和增殖水平（F5,20=0.766，P=0.912）并沒有顯著作用；對ERK1/2的表達也沒有顯著影響（F5,24=0.098，P=0.992），但是對pERK1/2（F5,24=3.147，P=0.025）以及BDNF（F5,30=2.615，P=0.045）的表達卻存在顯著

20、差異。多重比較結(jié)果顯示，在劑量為20μg/mL或40μg/mL時卻可以促進ERK磷酸化水平，而且在劑量為20μg/mL的情況下還可以促進BDNF的釋放。經(jīng)過U0126干預(yù)后，經(jīng)雙因素方差分析，星形膠質(zhì)細胞ERK1/2的表達沒有顯著變化（F=0.245，P=0.992），但是對pERK1/2（F=0.591，P<0.001）以及BDNF（F=22.277，P<0.001）的表達卻存在顯著影響。而且不同RA劑量+U0126組之間均沒有顯著性

21、差異（P>0.05）。
　　實驗四部分，通過原代培養(yǎng)獲得星形膠質(zhì)細胞，在細胞培養(yǎng)基中加入不同劑量的RA作用48 h或72 h，結(jié)果顯示：直接給予不同劑量RA作用72 h對星形膠質(zhì)細胞細胞活力（F5,30=0.351，P=0.0306）和增殖水平（F5,25=6.693，P<0.01）均具有促進作用；對BDNF（F5,30=3.251，P=0.016）的水平也具有促進作用。多重比較結(jié)果顯示，在劑量為20μg/mL或40μg/mL時可

22、以促進星形膠質(zhì)細胞增殖，而且在劑量為20μg/mL的情況下還可以促進其細胞活力和GDNF的釋放。
　　結(jié)論：
　　CUS模型大鼠表現(xiàn)明顯的抑郁樣行為，而一定劑量的RA干預(yù)能改善這一行為表現(xiàn)，并且緩解由CUS所致海馬pERK1/2和BDNF、GDNF水平下降的情況，但是，應(yīng)用ERK磷酸化抑制劑U0126可以阻斷上述效應(yīng)；一定劑量的RA還可以促進海馬星形膠質(zhì)細胞ERK磷酸化和BDNF的表達，這一作用同樣可以被U0126阻斷；此外