高濃度碘對MT-Ⅰ-ⅡKO小鼠甲狀腺氧化應激的實驗研究.pdf

1、目的:
　　研究高濃度碘對金屬硫蛋白Ⅰ/Ⅱ敲除小鼠(MetallothioneinⅠ/Ⅱ Knockoutmice，MT-Ⅰ/Ⅱ KO mice)甲狀腺線粒體氧化應激—抗氧化防御的影響，探討在有和沒有MT-Ⅰ/Ⅱ的情況下，高濃度碘對小鼠甲狀腺細胞氧化應激—抗氧化防御的機制，并用碘轉運的競爭抑制劑過氯酸鹽(KClO4)，促甲狀腺激素(thyrotropin，TSH)，TPO的抑制劑(抗甲狀腺藥丙基硫氧嘧啶(propylthioura

2、cil，PTU)進行干預，研究高濃度碘對MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠甲狀腺線粒體氧化應激—抗氧化防御的影響。
　　方法:
　　在細胞水平
　　1.制備同源對照小鼠(Wild type mice，WT mice)及MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠甲狀腺細胞懸液，分別給予10-4mol/L、10-3mol/L、10-2mol/L的KI和10-3mol/L H2O2處理2h，①利用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetra

3、zolium，MTT)比色法檢測細胞活力。②利用MitoSOX通過流式細胞術檢測甲狀腺細胞線粒體超氧化物生成。③利用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒檢測細胞培養(yǎng)液上清的LDH漏出率。④利用Western blot免疫印跡法檢測Prx3蛋白水平表達的變化。
　　2.用10-4mol/L KI加或不加30μmol/L KClO4處理2h，檢測WT小鼠及MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠甲狀腺細胞線粒體超氧化物

4、生成、細胞活力、LDH漏出率。
　　3.用10-4mol/L KI加或不加300μmol/L PTU處理2h，檢測WT小鼠及MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠甲狀腺細胞線粒體超氧化物生成、細胞活力、LDH漏出率。
　　4.用10-4mol/L KI加或不加10U/L TSH處理2h，檢測WT小鼠及MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠甲狀腺細胞活力、LDH漏出率。
　　在動物水平
　　建立短期碘過量的動物模型，①適碘組(NI)②10倍碘過量

5、組(10HI)③100倍碘過量組(100HI)，喂養(yǎng)14天后開始實驗。
　　1.采用過硫酸銨消化砷鈰催化分光光度法測定尿碘含量。2.計算甲狀腺臟體比。3.HE染色觀察甲狀腺形態(tài)學變化。4.甲狀腺激素水平的測定。5.通過MTT法檢測細胞活力。6.利用LDH檢測細胞培養(yǎng)液上清的LDH漏出率。7.利用MitoSOX通過流式細胞術檢測甲狀腺細胞線粒體超氧化物生成。
　　8.利用Western blot免疫印跡法檢測Prx3蛋白水平表

6、達的變化。
　　結果:
　　在細胞水平
　　1.無論WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠，10-4mol/L、10-3mol/L、10-2mol/L的KI和10-3mol/LH2O2可誘導小鼠甲狀腺細胞活力下降(P＜0.01)，LDH漏出率增加(P＜0.01)，線粒體超氧化物生成增多(P＜0.01);流式細胞術分析顯示MT-Ⅰ/Ⅱ KO較WT小鼠的線粒體超氧化物生成增加更明顯(P＜0.01)。隨著KI濃度的增加，明顯增加了小鼠

7、甲狀腺Prx3的表達水平(P＜0.05)，且WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠之間有差異(P＜0.05)。
　　2.PTU、KClO4和TSH抑制高濃度碘誘導的MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠甲狀腺相對細胞活力的下降、LDH漏出率的增加、線粒體超氧化物生成的增加。
　?、贌o論WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠，KI(100μM)可誘導小鼠甲狀腺細胞的相對活力顯著下降。加入PTU(300μM)或KClO4(30μM)亦或者TSH(10U/L)處理后

8、，較單純KI(100μM)處理組，細胞活力顯著升高(P＜0.01)。與WT小鼠相比，MT-Ⅰ/ⅡKO小鼠細胞活力降低更加明顯(P＜0.01)。
　?、跓o論WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠，PTU(300μM)、KClO4(30μM)和TSH(10U/L)可顯著抑制KI(100μM)誘導的線粒體超氧化物生成增多(P＜0.01)。WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠之間相比，各種處理下MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠線粒體超氧化物生成升高更加明顯(P＜0.

9、05)。
　　③無論WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠，KI(100μM)可誘導小鼠甲狀腺細胞LDH漏出率顯著增加。加入PTU(300μM)或KClO4(30μM)亦或者TSH(10U/L)處理后，較單純KI(100μM)處理組，LDH漏出率顯著降低(P＜0.01)。與WT小鼠相比，MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠LDH漏出率增加更加明顯(P＜0.01)。
　　在動物水平
　　1.小鼠在喂養(yǎng)到14天時，無論在WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小

10、鼠中，3組尿碘水平隨攝入量增加依次成倍升高(p＜0.05)，與WT小鼠比較，MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠尿碘濃度更高(p＜0.05)。
　　2.小鼠在喂養(yǎng)到14天時，臟體比顯示無論在WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠中，NI組與100HI組之間有一定差異(p＜0.05)，NI組與10HI組之間無明顯差異。
　　3.無論在WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠，10HI組和100HI組與NI組比較，血清甲狀腺激素T3、T4、FT3、FT4水平變化均

11、沒有顯著性差異(P＞0.05)，與WT小鼠比較，在MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠，100HI組血清FT4水平顯著升高(P＜0.05)。
　　4.在鏡下觀察，在MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠和小鼠中，NI組和10HI甲狀腺多為中等大小濾泡，100HI組甲狀腺與NI組比較，表現(xiàn)為:有明顯的炎癥浸潤，既有部分濾泡明顯增大，部分濾泡接近正常略有增生;也有部分濾泡變小，濾泡腔變小，在WT小鼠中，表現(xiàn)更明顯。
　　5.無論在WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠

12、中，100HI組與NI組相比，細胞活力均明顯降低(p＜0.01)，但WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠之間相比，MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠細胞活力降低更明顯(p＜0.01)，NI組與10HI組之間無明顯差異。
　　6.無論在WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠中，100HI組與NI組相比，細胞損傷均明顯升高(p＜0.01)，但WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠之間相比，MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠細胞損傷升高更明顯(p＜0.01)，NI組與10HI組之間無明顯

13、差異。
　　7.無論在WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠中，100HI組與NI組相比，線粒體超氧化物生成均明顯升高(p＜0.01)，但WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠之間相比，MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠線粒體超氧化物生成升高更明顯(p＜0.05)，NI組與10HI組之間無明顯差異。
　　8.無論在WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠中，100HI組與NI組相比，Prx3表達水平均升高(p＜0.05)，但WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠之間相比，MT-

14、Ⅰ/Ⅱ KO小鼠Prx3表達水平升高更明顯(p＜0.05)，NI組與10HI組之間無明顯差異。
　　結論:
　　1.金屬硫蛋白Ⅰ/Ⅱ在高濃度碘誘導的甲狀腺氧化應激和抗氧化防御中具有一定的保護作用。
　　2.在MT-Ⅰ/Ⅱ KO和WT小鼠，高濃度碘均可誘導甲狀腺細胞線粒體超氧化物生成增加。
　　3.PTU（300μmol/L）可以減輕高濃度碘誘導的MT-Ⅰ/Ⅱ KO和WT小鼠甲狀腺細胞的氧化應激。
　　4.K