靶向Stathmin的siRNA與紫杉醇聯(lián)合作用于鼻咽癌細胞的效應(yīng)及機制的研究.pdf

1、目的：微管是構(gòu)成細胞骨架的主要組成成分之一，其對于細胞的各種主動運動至關(guān)重要，這包括細胞形態(tài)的改變、細胞的移動、染色體的分離和細胞的分裂等。細胞中各種微管結(jié)構(gòu)和功能的差異決定于其亞細胞定位及其與之結(jié)合的微管結(jié)合蛋白。Stathmin就是一個已經(jīng)明確的使微管失穩(wěn)定的微管結(jié)合蛋白，它通過促使微管解聚和隔離組成微管的Tubulin亞基而使微管失穩(wěn)定，多種激酶可以通過磷酸化和去磷酸化而使Stathmin蛋白的微管失穩(wěn)定活性失活和活化。鼻咽癌是中

2、國人群特有的高發(fā)腫瘤，EB病毒的感染與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，EB病毒編碼的潛伏膜蛋白LMP1是一個已經(jīng)確認的瘤致蛋白質(zhì)。前期的研究發(fā)現(xiàn)Stathmin是LMP1調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個下游分子，LMP1可以通過多條通路調(diào)節(jié)Stathmin的磷酸化，使微管失穩(wěn)定而促使細胞永生化、增強腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。
　　 siRNA是人工RNAi技術(shù)中一個重要小分子，其可以激發(fā)與之互補的目標mRNA的沉默。具有高特異性、高效率、可遺傳等重要

3、特性。本研究以期通過構(gòu)建的靶向Stathmin的siRNA質(zhì)粒沉默其蛋白質(zhì)的表達，降低微管的解聚，增強微管的聚合，從而促使腫瘤細胞凋亡、抑制其增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。
　　 紫杉醇是作用于細胞微管的主要抗腫瘤藥物之一，它通過促進微管聚合，抑制其解聚，保持微管穩(wěn)定，抑制細胞有絲分裂，具有顯著的放射增敏作用，有著與靶向Stathmin的siRNA類似的作用。因此，本研究擬通過二者聯(lián)合應(yīng)用以期放大它們對腫瘤細胞的生物學效應(yīng)。
　　

4、方法：本文以鼻咽癌細胞CNE1-LMP1為研究模型，用本實驗室構(gòu)建的靶向Stathmin的siRNA質(zhì)粒為策略，探討靶向Stathmin的siRNA抑制其蛋白質(zhì)的表達而對鼻咽癌細胞的凋亡和增殖、侵襲和遷移的影響，并評價Stathmin的siRNA與抗微管化療藥物聯(lián)合應(yīng)用的效應(yīng)。
　　 本研究首先以RT-PCR和Western blot證實本研究所應(yīng)用的靶向Stathmin的siRNA質(zhì)?？煞褚种票茄拾┘毎鸆NE1-LMP1的St

5、athmin的mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平。以MTT實驗證實靶向siRNA對鼻咽癌細胞生長增殖的抑制作用。利用流式細胞術(shù)確定靶向Stathmin的siRNA誘導鼻咽癌細胞的凋亡、細胞周期和線粒體膜電位的改變，以AO/EB染色和TUNEL實驗證實其對鼻咽癌細胞凋亡的誘導作用，以Western blot檢測siRNA轉(zhuǎn)染后細胞凋亡標志性蛋白質(zhì)Caspase的變化，以期確認鼻咽癌細胞的凋亡及凋亡途徑。
　　 其次，以Western bl

6、ot檢測轉(zhuǎn)染靶向Stathmin的siRNA的鼻咽癌細胞中可溶性微管和聚合性微管比例的變化。以間接熒光染色檢測該siRNA質(zhì)粒對微管多聚化的調(diào)節(jié)作用。以劃痕實驗檢測該siRNA對鼻咽癌細胞在二維平面上遷移能力的影響。以Transwell檢測該siRNA對鼻咽癌細胞在三維基質(zhì)中遷移和侵襲能力的調(diào)節(jié)。
　　 再次，以MTT實驗檢測轉(zhuǎn)染靶向Stathmin的siRNA和紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用對鼻咽癌細胞增殖作用的影響。以流式細胞術(shù)檢測二者聯(lián)合

7、應(yīng)用對細胞的促凋亡作用和細胞周期的改變。以間接熒光法和Westernblot檢測轉(zhuǎn)染該siRNA和紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用對鼻咽癌細胞微管產(chǎn)生影響。
　　 最后，以RT-PCR和 Western blot檢測紫杉醇對鼻咽癌細胞以及其它多種高表達Stathmin細胞A375、MGC和Hela中Stathmin表達在mRNA和蛋白水平的調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)果：首先，RT-PCR和Western blot實驗證實了本研究所用的靶向Sta

8、thmin的siRNA質(zhì)?？梢悦黠@抑制鼻咽癌細胞Stathmin的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平。MTT實驗檢測細胞的生長曲線顯示該siRNA的轉(zhuǎn)染對鼻咽癌細胞的增殖也有明顯的抑制作用。流式細胞術(shù)分析顯示該siRNA可明顯促進鼻咽癌細胞的凋亡(達到30.9％)，使腫瘤細胞阻滯于C2/M期(16.3％)。同時，AO/EB染色、TUNEL實驗以及 Western blot檢測凋亡標志性蛋白Caspase-3、8和9也進一步證實該siRNA對細胞凋

9、亡的促進作用。并且，Caspase和線粒體膜電位的檢測也明確該siRNA是通過線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡的。
　　 其次，Western blot證實向鼻咽癌細胞轉(zhuǎn)染靶向Stathmin的siRNA可明顯增加細胞的聚合性微管的量而減少可溶性微管，使得聚合性微管/可溶性微管的比值明顯提高(P/S=3.43)；間接免疫熒光也顯示轉(zhuǎn)染siRNA的細胞微管長而成束，熒光強度明顯提高。雖然二維的劃痕實驗并沒有顯示轉(zhuǎn)染了該siRNA的鼻咽癌

10、細胞運動能力有明顯的改變，但 Transwell實驗顯示轉(zhuǎn)染該siRNA的細胞遷移和侵襲能力都受到明顯抑制。
　　 再次，將靶向Stathmin的siRNA質(zhì)粒和紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用于鼻咽癌細胞CNE1-LMP1。MTT實驗顯示聯(lián)合應(yīng)用對細胞增殖的抑制效果明顯高于其中任何一種方式的單獨應(yīng)用。而且，轉(zhuǎn)染了該siRNA的細胞，其細胞增殖的受抑制的程度與紫杉醇在一定的濃度范圍內(nèi)有劑量關(guān)系。間接免疫熒光實驗同樣顯示雖然二者單獨應(yīng)用都可以一定程

11、度上使被處理的細胞微管變粗和變長，熒光強度有所增強，但二者聯(lián)合應(yīng)用的結(jié)果顯示出微管變得更粗和更長，熒光強度更強。同樣，Western blot檢測細胞的可溶性和聚合性微管的量也顯示雖然二者單獨應(yīng)用都可以一定程度上使被處理細胞的聚合性微管增加，可溶性微管減少，聚合性微管/可溶性微管的比值有所增加。但二者聯(lián)合使用，細胞中的聚合性微管增加和可溶性微管減少的程度要明顯的多，聚合性微管/可溶性微管的比值顯著提高(P/S=2.05)。
　　

12、 最后，研究還發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌細胞以及其它多種高表達Stathmin的腫瘤細胞中，紫杉醇對細胞中的Stathmin表達有明顯的抑制作用，而且，在鼻咽癌細胞中，這種抑制作用與紫杉醇的濃度有一定的劑量效應(yīng)。
　　 結(jié)論：靶向Stathmin的siRNA通過抑制其蛋白質(zhì)的表達而抑制鼻咽癌細胞的增殖，遷移和侵襲，并通過線粒體途徑促進細胞凋亡。這種對鼻咽癌細胞凋亡和增殖，遷移和侵襲的調(diào)控是通過增強微管的聚合而減少其降解，使微管多聚化、使微管穩(wěn)