Raptor介導(dǎo)小豆蔻明抑制SKOV3細(xì)胞增殖的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：⑴明確Raptor調(diào)控mTORC1(mammalian target of rapamycin complex1)通路活性的重要地位；⑵探索Raptor（regulatory associated protein of mTOR）在小豆蔻明（Cardamonin，CAR）下調(diào)mTORC1通路活性、抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。
　　方法：①將人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株及經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Raptor siRNA的SKOV

2、3細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100μg·mL-1鏈霉素及100 U·mL-1青霉素的McCoy's5A培養(yǎng)液中，并置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待貼壁細(xì)胞長至70%-80%時(shí)用胰蛋白酶消化傳代。凍存細(xì)胞加入適量凍存液（DMSO﹕血清=1﹕9），混勻后于4℃冰箱中放置約40 min，再放入﹣20℃冰箱約1 h，最后移入﹣80℃冰箱保存。②干擾及未干擾的SKOV3細(xì)胞分別設(shè)立空白組、CAR組（5、20μM）、陽性對照藥雷帕霉素（R

3、apamycin，RAP）組（0.1μM）及AZD8055（0.1μM）組。③倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長狀況；④MTT法檢測細(xì)胞增殖；⑤聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）觀察轉(zhuǎn)染效率與干擾效果；⑥Western Blotting法檢測 mTOR、p-mTOR、Raptor、p-Raptor、PRAS40、p-PRAS40、S6K1、p-S6K1蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴CAR顯著抑制mTOR、Raptor、PRAS40及S6K1的蛋白磷酸

4、化，同時(shí)抑制Raptor總蛋白表達(dá)，均呈濃度依賴性；⑵Raptor siRNA的SKOV3細(xì)胞，其Raptor mRNA和蛋白表達(dá)降低；⑶mTOR、Raptor、PRAS40、S6K1的磷酸化蛋白及Raptor的總蛋白表達(dá)在Raptor siRNA的SKOV3細(xì)胞顯著低于SKOV3細(xì)胞；細(xì)胞經(jīng)CAR處理后，mTOR、Raptor、PRAS40、S6K1的磷酸化蛋白及Raptor總蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低；⑷CAR顯著抑制Raptor siRN