Raptor介導小豆蔻明抑制SKOV3細胞增殖的作用機制研究.pdf

1、目的：⑴明確Raptor調(diào)控mTORC1(mammalian target of rapamycin complex1)通路活性的重要地位；⑵探索Raptor（regulatory associated protein of mTOR）在小豆蔻明（Cardamonin，CAR）下調(diào)mTORC1通路活性、抑制卵巢癌SKOV3細胞增殖的作用機制。
　　方法：①將人卵巢癌SKOV3細胞株及經(jīng)脂質(zhì)體法轉染Raptor siRNA的SKOV

2、3細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100μg·mL-1鏈霉素及100 U·mL-1青霉素的McCoy's5A培養(yǎng)液中，并置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待貼壁細胞長至70%-80%時用胰蛋白酶消化傳代。凍存細胞加入適量凍存液（DMSO﹕血清=1﹕9），混勻后于4℃冰箱中放置約40 min，再放入﹣20℃冰箱約1 h，最后移入﹣80℃冰箱保存。②干擾及未干擾的SKOV3細胞分別設立空白組、CAR組（5、20μM）、陽性對照藥雷帕霉素（R

3、apamycin，RAP）組（0.1μM）及AZD8055（0.1μM）組。③倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)及生長狀況；④MTT法檢測細胞增殖；⑤聚合酶鏈式反應（PCR）觀察轉染效率與干擾效果；⑥Western Blotting法檢測 mTOR、p-mTOR、Raptor、p-Raptor、PRAS40、p-PRAS40、S6K1、p-S6K1蛋白表達。
　　結果：⑴CAR顯著抑制mTOR、Raptor、PRAS40及S6K1的蛋白磷酸

4、化，同時抑制Raptor總蛋白表達，均呈濃度依賴性；⑵Raptor siRNA的SKOV3細胞，其Raptor mRNA和蛋白表達降低；⑶mTOR、Raptor、PRAS40、S6K1的磷酸化蛋白及Raptor的總蛋白表達在Raptor siRNA的SKOV3細胞顯著低于SKOV3細胞；細胞經(jīng)CAR處理后，mTOR、Raptor、PRAS40、S6K1的磷酸化蛋白及Raptor總蛋白表達進一步降低；⑷CAR顯著抑制Raptor siRN