TC-1的表達(dá)水平與肺腺癌胸水腫瘤細(xì)胞抗脫落凋亡的相關(guān)性研究.pdf

1、脫落凋亡,為上皮細(xì)胞與其細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix, ECM)脫離后繼而出現(xiàn)的細(xì)胞凋亡,1994年Frisch SM等首次報(bào)道了這一現(xiàn)象,并命名為“anoikis”[1]。
　　脫落凋亡為機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制,其意義在于它可防止上皮細(xì)胞與ECM脫離后經(jīng)各種管道系統(tǒng)或經(jīng)機(jī)體各種腔隙播散至其它臟器繼續(xù)生長(zhǎng),保證機(jī)體穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)。癌細(xì)胞作為上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞卻能自原發(fā)部位脫落后,遷徙到其它部位臟器中繼續(xù)

2、生長(zhǎng),甚至其異位的環(huán)境完全不適合原部位正常上皮細(xì)胞的生長(zhǎng),而形成轉(zhuǎn)移瘤[2]。
　　這一現(xiàn)象說(shuō)明能夠發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞具備抗脫落凋亡能力。抗脫落凋亡被廣泛認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的一種重要原因。肺癌胸膜轉(zhuǎn)移致胸膜腔可形成惡性胸腔積液(malignant pleural effusion,MPE)。胸水中懸浮有大量的腫瘤細(xì)胞,這些腫瘤細(xì)胞能夠在MPE中懸浮狀態(tài)下存活并在臟壁層胸膜種植轉(zhuǎn)移,使臟層及壁層胸膜形成轉(zhuǎn)移灶。
　　這一現(xiàn)象說(shuō)明惡性

3、胸水中的腫瘤細(xì)胞已具備抗脫落凋亡能力。因此,胸水中的腫瘤細(xì)胞為機(jī)體內(nèi)相對(duì)易取的典型抗脫落凋亡細(xì)胞。脫落凋亡/抗脫落凋亡機(jī)制復(fù)雜,目前尚未闡明;大量研究表明,有多種因素可能參與了腫瘤細(xì)胞脫落凋亡/抗脫落凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制,包括多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑及其它相關(guān)因素;TC-1(C8orf4)基因是近期發(fā)現(xiàn)的與炎癥及腫瘤相關(guān)的基因。最早發(fā)現(xiàn)其在甲狀腺癌中表達(dá)異常增高[3],同時(shí)有研究報(bào)道其在懸浮培養(yǎng)的高侵襲性肺腺癌A549細(xì)胞系中同樣高表達(dá)[4-5]。然而

4、TC-1基因在肺癌中的表達(dá)水平與肺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移侵襲能力的關(guān)系尚無(wú)定論,其在肺癌抗脫落凋亡屬性中的作用上仍需進(jìn)一步考證。
　　目的:
　　探討惡性胸水腫瘤細(xì)胞分離的合適方法,建立肺腺癌腫瘤細(xì)胞抗脫落凋亡模型。對(duì)胸水中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)及形態(tài)學(xué)研究,并探討TC-1基因的表達(dá)水平與肺腺癌腫瘤細(xì)胞抗脫落凋亡之間的關(guān)系。
　　方法:
　　一:取已病理確診肺腺癌胸膜轉(zhuǎn)移的惡性胸水腫瘤細(xì)胞,利用多聚羥乙基甲基丙烯酸樹脂

5、處理培養(yǎng)皿,致細(xì)胞無(wú)法貼壁生長(zhǎng),通過(guò)梯度密度離心法分離并純化腫瘤細(xì)胞,建立胸水腫瘤細(xì)胞抗脫落凋亡模型;
　　二:以肺腺癌原發(fā)灶原代培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞為對(duì)比,對(duì)胸水腫瘤細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、MTT法測(cè)定細(xì)胞數(shù),繪制生長(zhǎng)曲線和計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間、流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡率;
　　三:利用免疫組織化學(xué)法及western blot法檢測(cè)TC-1基因在原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞及胸水腫瘤細(xì)胞間的表達(dá)差異,MTT法檢測(cè)TC-1基因相關(guān)通路抑制劑對(duì)

6、兩組腫瘤細(xì)胞的抑制效果。
　　結(jié)果:
　　一:利用兩次梯度密度離心法可有效分離純化胸水中的腫瘤細(xì)胞,建立體外懸浮培養(yǎng)人體胸水腫瘤細(xì)胞抗脫落凋亡模型,體外懸浮培養(yǎng)時(shí)間約4周左右。
　　二:對(duì)胸水腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)及形態(tài)學(xué)的研究發(fā)現(xiàn):
　　1.原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線存在明顯的階段分布:即潛伏期、對(duì)數(shù)期、平臺(tái)期;而胸水腫瘤細(xì)胞其生長(zhǎng)曲線低平,近似直線,無(wú)明顯階段分布,細(xì)胞增殖緩慢,細(xì)胞倍增時(shí)間為(115.74±15.3

7、8)h;
　　2.細(xì)胞周期分布檢測(cè),胸水腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期分布為:G0、G1期(58.95±4.13)％、S期(26.2±3.7)％、G2期(14.85±1.3)％;近60％的細(xì)胞處于細(xì)胞靜止期;
　　3.細(xì)胞凋亡率:原發(fā)組及胸水組中活細(xì)胞數(shù)占90％以上,凋亡及壞死細(xì)胞總數(shù)小于10％。原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞懸浮培養(yǎng)48h后活細(xì)胞數(shù)為(38.9±6.9)％,凋亡及壞死細(xì)胞總數(shù)大于60％;
　　4.掃描電鏡示胸水組與原發(fā)組相比較,

8、胸水組中腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)育缺陷,其細(xì)胞膜微孔增大增多、細(xì)胞纖毛減少、呈球樣及板樣變;少量腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小泡呈凋亡前期樣變化。
　　三:
　　1.免疫組織化學(xué)及western blot檢測(cè)TC-1基因在胸水腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平明顯高于原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞,兩組細(xì)胞在TC-1的表達(dá)水平上存在差異;
　　2.應(yīng)用TC-1通路相關(guān)抑制劑PD176074可促使懸浮著的胸水腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)大批凋亡及壞死,抑制率為54.43％,而PD17607