青蒿素類抗瘧藥大鼠體內自身誘導代謝機理的研究.pdf

1、目的：青蒿素類抗瘧藥是含內過氧橋結構的倍半萜內酯類化合物。近年來研究發(fā)現(xiàn)這類藥物具有自身誘導代謝現(xiàn)象，且青蒿素類藥物在人體內由CYP2B6和CYP3A4介導代謝，并能誘導CYP2C19。而核受體超家族是介導CYP450誘導的關鍵調控因子，其中主要有孤兒核受體孕烷X受體(PXR)及組成型雄烷受體(CAR)。青蒿素類藥物是否通過激活核受體PXR或CAR而導致其對CYP450的誘導，目前尚不清楚。本文選擇青蒿素類衍生物的母體化合物青蒿素(AR

2、T)及該類衍生物的活性代謝物雙氫青蒿素(DHA)作為目標藥物，以CYP2B、CYP3A和CYP2C為考察目標，從藥物代謝角度，采用分子生物學方法(PCR、Westernblot)，在體內條件下，探討了該類藥物對CYP450的誘導機制。
　　 方法：將SD大鼠隨機分成8組(每組6只)?？诜嗀RT誘導組：80mg/kg/d；口服DHA誘導組：10 mg/kg/d；口服溶劑對照組；靜注ART誘導組：16mg/kg/d；靜注DHA誘導組

3、：5mg/kg/d；靜注溶劑(ART)對照組；靜注溶劑(DHA)對照組；空白對照組：不經任何處理。均連續(xù)給藥5天，末次給藥24h后處死大鼠，取出肝臟，用于mRNA、酶活性和蛋白的測定。
　　 結果：(1)mRNA的測定：取肝組織，Trizol一步法提取總RNA，采用實時熒光定量PCR檢測PXR、CAR、CYP3A1、CYP2B1及CYP2C6 mRNA。2-△△Ct法計算相對定量結果。相比溶劑對照組和空白對照組，口服ART和DH

4、A誘導組大鼠CYP2B1 mRNA水平顯著增加(P＜0.001)，口服ART誘導組大鼠CARmRNA水平顯著增加(P＜0.001)，而靜注ART和DHA誘導組大鼠核受體及CYP450 mRNA水平與對照組間均無顯著性差異。(2)酶活性的測定：超速離心法制備肝微粒體，并用紫外分光光度法測定蛋白濃度及CYP450含量?？诜嗀RT誘導組CYP450含量為：1.45nmol/mg；口服DHA誘導組CYP450含量為：1.38 nmol/mg；口

5、服溶劑對照組CYP450含量為：0.81nmol/mg；空白對照組CYP450含量為：0.79 nmol/mg；靜注ART誘導組CYP450含量為：0.75nmol/mg；靜注溶劑(ART)對照組CYP450含量為：0.78nmol/mg；DHA多劑量靜注誘導組CYP450含量為：0.79nmol/mg；靜注溶劑(DHA)組CYP450含量為：0.84nmol/mg。相比溶劑對照組和空白組，口服ART和DHA誘導組大鼠CYP450含量均

6、較高。Nash法測定微粒體中CYP3A同工酶催化的紅霉素N-去甲基化酶活性?？诜嗀RT誘導組單位時間內甲醛生成量為：2.29μmol/mg/min；多劑量DHA口服誘導組單位時間內甲醛生成量為：1.75μmol/mg/min；口服溶劑對照組單位時間內甲醛生成量為：0.82μmol/mg/min；空白對照組單位時間內甲醛生成量為：0.75μmol/mg/min；靜注ART誘導組單位時間內甲醛生成量為：0.72μmol/mg/min；靜注溶

7、劑(ART)對照組單位時間內甲醛生成量為：0.75μmol/mg/min；靜注DHA誘導組單位時間內甲醛生成量為：0.79μmol/min；靜注溶劑(DHA)對照組單位時間內甲醛生成量為：0.85μmol/mg/min。相比溶劑對照組和空白組，口服ART和DHA誘導組大鼠CYP3A1酶活性較高。熒光分光光度法測定微粒體中CYP2B同工酶活性?？诜嗀RT誘導組單位時間內9-羥基-3-異惡唑生成量為：10.30×10-3μmol/mg/mi

8、n；口服DHA誘導組單位時間內9-羥基-3-異惡唑生成量為：8.19×10-3μmol/mg/min；口服溶劑對照組單位時間內9-羥基-3-異惡唑生成量為：5.68×10-3μmol/mg/min；空白對照組單位時間內9-羥基-3-異惡唑生成量為：5.41×10-3μmol/mg/min；靜注ART誘導組單位時間內9-羥基-3一異惡唑生成量為：5.24×10-3μmol/mg/min；靜注溶劑(ART)對照組單位時間內9-羥基-3-異惡

9、唑生成量為：5.26×10-3μmol/mg/min：靜注DHA誘導組單位時間內9-羥基-3-異惡唑生成量為：5.25×10-3μmol/mg/min；靜注溶劑(DHA)對照組單位時間內9-羥基-3-異惡唑生成量為：5.74×10-3μmol/mg/min。相比溶劑對照組和空白組，口服ART和DHA誘導組大鼠CYP2B1酶活性較高。高效液相色譜法測定CYP2C6底物雙氯芬酸鈉經微粒體孵化后剩余量以檢測CYP2C6酶活性?？诜嗀RT誘導組

10、單位時間內雙氯芬酸鈉代謝率為：31.20％：口服DHA誘導組單位時間內雙氯芬酸鈉代謝率為：18.02％；口服溶劑對照組單位時間內雙氯芬酸鈉代謝率為：16.54％；空白對照組單位時間內雙氯芬酸鈉代謝率為：16.37％；靜注ART誘導組單位時間內雙氯芬酸鈉代謝率為：15.59％；靜注溶劑(ART)對照組單位時間內雙氯芬酸鈉代謝率為：16.02％：靜注DHA誘導組單位時間內雙氯芬酸鈉代謝率為：16.41％：靜注溶劑(DHA)對照組單位時間內雙

11、氯芬酸鈉代謝率為：17.93％。相比溶劑對照組和空白組，口服ART誘導組大鼠CYP2C6酶活性較高。(3)蛋白的測定：提取肝組織總蛋白，Westem blot測定PXR和CAR蛋白，對比對照組，實驗組無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；制備的肝微粒體，Westernblot測定CYP3A1、CYP2B1及CYP2C6蛋白，對比對照組，實驗組無明顯差別。
　　 結論：以上結果表明，多劑量口服青蒿素能上調大鼠CAR受體及CYP2B的mRN