胸腺素α1-胸腺五肽融合肽的制備、體內外免疫調節(jié)與輔助抗腫瘤作用及與TLR2結合性質研究.pdf

1、惡性腫瘤致死率高，是當前嚴重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一。目前，臨床上主要采用的非手術治療手段有化學治療、放射治療等，但這些手段在治療腫瘤的同時也使患者的免疫功能受到嚴重破壞。因此，尋找能夠在腫瘤治療中提高機體免疫功能的免疫調節(jié)劑具有重大的社會和經濟意義。胸腺五肽(Thymopentin，TP5)和胸腺素α1(Thymosin，Tα1)是從胸腺中獲得的兩種多肽，二者具有相似的免疫調節(jié)活性，是重要的免疫調節(jié)劑，已成功用于臨床腫

2、瘤輔助治療，能提高化療或放療病人的免疫應答及耐受性，抑制或降低病情的進展或復發(fā)，延長病人的生存期，提高病人的生活質量。但是，TP5的體內半衰期(t1/2)很短，人體內藥代學研究發(fā)現TP5的t1/2只有30s。需要頻繁的給藥才能維持療效。Tα1的體內t1/2較長（約為100min），但目前主要以化學合成的方法生產，價格昂貴，難以被廣大患者所接受。
　　 為了提高TP5的活性，延長其體內t1/2，本課題組已將具有相似生物活性與臨床用

3、途的TP5和Tα1借助基因工程方法連接在了一起，在畢赤酵母Pichiapastoris中表達制備了融合肽Tα1-TP5。研究證實Tα1-TP5具有比TP5更強的體外刺激小鼠脾淋巴細胞增殖及體內促進巨噬細胞吞噬的能力，Tα1-TP5也具有比TP5及Tα1更長的體外血漿t1/2。但是，Tα1-TP5經Pichiapastoris分泌表達的量很少，無法滿足進一步體內試驗研究的需求，并且需要凝血酶切割去掉融合標簽，純化成本高，純化步驟繁瑣。切割

4、后，Tα1-TP5的N端帶有2個多余的氨基酸殘基，C端帶有多余的4個氨基酸殘基，可能存在免疫原性。
　　 故為了提高產量并降低純化成本，本課題換用大腸桿菌表達體系，采用內含肽介導的純化系統(tǒng)，加入二硫蘇糖醇(DTT)誘導內含肽自切割，分別從細菌裂解上清及包涵體中純化Tα1-TP5?？疾霻α1-TP5是否具有比TP5及Tα1更強的體內免疫調節(jié)活性及輔助抗腫瘤作用，并進一步采用表面等離子共振技術(SPR)研究Tα1-TP5與Toll樣

5、受體2(TLR2)的結合情況，為將Tα1-TP5開發(fā)成一種新型的免疫調節(jié)劑提供重要的基礎與依據。
　　 本課題的研究內容及取得的主要成果有以下幾個方面。
　　 1、Tα1-TP5在大腸桿菌中的表達及純化
　　 采用大腸桿菌表達系統(tǒng)對Tα1-TP5進行了融合表達。選用pTYB2作為表達載體，將Tα1-TP5基因插入至內含肽(Sceintein)基因的N端，Sceintein基因的C端與幾丁質結合域(Chitinbi

6、ndingdomain，CBD)相連，構建重組質粒pTYB2-Tα1-TP5-Sceintein-CBD，轉入E.coliER2566中誘導表達重組蛋白。超聲裂解菌體后SDS-PAGE考察重組蛋白的可溶表達情況?？疾觳煌T導溫度及誘導劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)濃度對重組蛋白可溶表達量的影響。采用親和層析對重組蛋白進行純化，加入DTT誘導intein柱上自切割，從而釋放Tα1-TP5。為了提高Tα1-TP5的產量，也從包涵

7、體中純化了Tα1-TP5。摸索了包涵體的洗滌條件，采用直接稀釋法對包涵體蛋白Tα1-TP5-Sceintein-CBD進行復性，并考察還原劑和氧化劑的比例、L-精氨酸(L-Arg)及最終尿素的濃度對復性效率的影響。復性后的蛋白過親和層析柱，加入DTT誘導intein柱上自切割，從而獲得Tα1-TP5。Tα1-TP5進一步經Superdex30純化并脫鹽后，ESI-MS鑒定其分子量的正確性。Tricine-SDS-PAGE鑒定Tα1-TP

8、5的純度。
　　 結果顯示，Tα1-TP5成功在E.coliER2566中表達，融合蛋白部分以包涵體的形式存在，誘導溫度由37℃降低至16℃時可使可溶蛋白的表達量由原來的15.9％增加至18.9％，而IPTG濃度由1mmol/L降至0.1mmol/L對可溶蛋白表達量影響不大。復性體系中還原劑和氧化劑的比例為1∶22.5、尿素終濃度為0.8mol/L時復性效率最高。L-Arg的加入對復性效率影響不大。Superdex30進一步純化

9、和脫鹽后，從菌體裂解上清中獲得了約4.6mgTα1-TP5，從包涵體中獲得了約3.0mgTα1-TP5。ESI-MS分別鑒定分子量，發(fā)現與理論值相當(3785.02Da)，Tricine-SDS-PAGE檢測Tα1-TP5的純度大于95％。最終我們運用此方法從每L發(fā)酵液中得到了約7.6mgTα1-TP5。
　　 2、Tα1-TP5體內外免疫調節(jié)活性研究
　　 采用CCK-8法測定了Tα1-TP5對小鼠脾淋巴細胞增殖的促進

10、作用，采用流式細胞術考察了Tα1-TP5對小鼠脾淋巴細胞表面CD69分子表達的促進作用，采用RT-PCR技術檢測Tα1-TP5對小鼠脾淋巴細胞IFN-γ表達的的影響。結果表明:從上清及包涵體中純化的Tα1-TP5均能促進小鼠脾淋巴細胞的增殖，且作用呈濃度依賴性，濃度為40μg/mL時，增殖率分別為26.21％、21.84％，與陰性組比較差異具有顯著性意義(p＜0.01，p＜0.01)。Tα1-TP5能促進CD69的表達，與陰性對照組比較

11、差異具有顯著性意義(21.51％vs.9.5％，p＜0.05)，Tα1-TP5促進淋巴細胞表面CD69表達的能力也較TP5(16.06％)和Tα1(16.65％)高。RT-PCR結果顯示Tα1-TP5能在基因水平上促進IFN-γ的表達，且促進IFN-γ表達的能力高于TP5及Tα1。說明我們純化的Tα1-TP5具有比TP5及Tα1更強的免疫調節(jié)活性。
　　 連續(xù)2天腹腔注射劑量為250mg/kg氫化可的松(HC)，建立小鼠體內免疫

12、抑制模型，皮下注射Tα1-TP5連續(xù)治療2周，考察Tα1-TP5對小鼠免疫抑制的抵抗作用。結果發(fā)現，Tα1-TP5能明顯增強免疫抑制小鼠的胸腺指數，與模型組比較差異具有顯著性意義（2.253±0.427vs.0.444±0.407，p＜0.05），與TP5及Tα1單獨給藥組比較差異也具有顯著性意義(p＜0.05)。但Tα1-TP5對脾臟指數的影響不大。HE染色分析Tα1-TP5能改善HC導致的胸腺萎縮，增加胸腺組織中胸腺細胞的數量。另外

13、Tα1-TP5能使CD4+CD8+胸腺細胞的比例恢復至正常水平。與模型組比較，Tα1-TP5顯著增加外周血中IFN-γ的含量，抵抗HC造成的IFN-γ水平降低?？傊?，Tα1-TP5具有改善HC誘導的免疫抑制狀態(tài)的能力，且活性比TP5及Tα1更強。
　　 3、Tα1-TP5輔助抗腫瘤作用研究
　　 采用CCK-8法測定了Tα1-TP5對乳腺癌細胞MDA-MB-231、肝癌細胞HepG2、肺癌細胞A549及黑色素瘤細胞B16

14、四種腫瘤細胞增殖的抑制作用，結果表明:Tα1-TP5對四種腫瘤細胞生長的抑制作用呈時間依賴性，對MDA-MB-231細胞的抑制作用最強，72h時細胞活力只占陰性組的64.6％，顯著高于TP5組(64.6％vs.90.8％，p＜0.05)，但是與Tα1組比較沒有顯著性差異（64.6％vs.70.2％，p＞0.05）。Tα1-TP5對HepG2細胞和A549細胞的抑制作用稍弱于對MDA-MB-231細胞，72h時細胞活力分別占陰性組的73.

15、9％及69.9％，抑制作用強于TP5但與Tα1差別不大。Tα1-TP5對B16細胞也有一定的抑制作用，72h時細胞活力只占陰性組的82.5％，抑制作用與TP5及Tα1相比沒有顯著性差異。
　　 建立C57BL/6小鼠荷黑色素瘤模型，考察Tα1-TP5聯(lián)合環(huán)磷酰胺(CY)對腫瘤生長的抑制作用。結果表明:與CY單獨給藥相比，Tα1-TP5聯(lián)合CY明顯降低腫瘤體積及腫瘤重量，藥物治療2周后腫瘤重量減少了將近88.1％。Tα1-TP5也

16、能逆轉CY導致的外周血中白細胞數量減少，治療2周后外周血中白細胞數量增加至正常水平。流式細胞術檢測腫瘤組織中組織相容性復合體Ⅰ(MHCⅠ)的表達，發(fā)現CY組MHCⅠ的表達率只有11.65％，而Tα1-TP5能顯著增加腫瘤組織中MHCⅠ的表達，與CY組比較差異具有顯著性(28.71％vs.11.65％，p＜0.05)。免疫組化結果顯示Tα1-TP5較TP5及Tα1更能促進腫瘤組織中CD8+T細胞的浸潤及CD86的表達?？梢奣α1-TP5具

17、有弱的直接殺傷B16細胞的功能，主要通過激活免疫系統(tǒng)而發(fā)揮輔助抗腫瘤作用。
　　 4、Tα1-TP5與TLR2結合活性研究
　　 采用激光共聚焦顯微鏡觀察考察Tα1-TP5與骨髓來源的巨噬細胞(BMDMs)的結合情況。將Tα1-TP5、TP5及Tα1分別用異硫氰酸熒光素(FITC)標記，并分別與分離的BMDMs孵育2h，再用Hoechst33342及DiI分別標記細胞核及細胞膜，激光共聚焦顯微鏡觀察藥物結合情況。結果發(fā)現

18、，Tα1-TP5、TP5及Tα1均能結合在BMDMs的細胞膜上。
　　 采用SPR技術檢測Tα1-TP5與存在于BMDMs上的TLR2的結合。將TLR2作為配體以氨基偶聯(lián)的方式偶聯(lián)到CM5芯片上，Tα1-TP5、TP5及Tα1作為待分析物流過芯片表面，考察三種多肽與TLR2的結合能力及親和力大小。結果顯示:SPR技術能夠準確反映三種多肽與TLR2的結合水平。Tα1-TP5、TP5及Tα1與TLR2的解離平衡常數（KD）分別為6.

19、84×10-6mol/L、1.57×10-6mol/L及35.4×10-6mol/L。Tα1-TP5與TLR2的結合能力顯著強于Tα1，但與TP5相比沒有顯著性差異。到目前為止，三種多肽可能的受體首次被確定。
　　 本研究取得的主要成果和結論如下:
　　 (1)首次構建了表達Tα1-TP5的大腸桿菌表達系統(tǒng)，對重組蛋白質成功進行了表達，并利用內含肽介導的純化系統(tǒng)分別從細菌裂解上清及包涵體中分離純化了Tα1-TP5，Sup

20、erdex30進一步純化得到了高純度的目的多肽。獲得的Tα1-TP5C端只含有一個多余的甘氨酸(Gly)殘基。此研究提供了一種高效率、低成本的純化策略，適合Tα1-TP5的大規(guī)模生產。
　　 (2)純化的Tα1-TP5能明顯促進小鼠脾淋巴細胞的增殖、CD69及IFN-γ的表達，展示了較好的體外免疫調節(jié)活性。
　　 (3)首次進行了Tα1-TP5的體內免疫調節(jié)活性研究。Tα1-TP5能抵抗HC誘導的免疫抑制，且效果較TP5