丙泊酚對荷瘤大鼠MADB106腫瘤細胞肺轉(zhuǎn)移及E-cadherin和β-catenin的影響.pdf

1、丙泊酚作為一種靜脈麻醉藥，在臨床麻醉中應(yīng)用廣泛。有研究表明，其可顯著增加細胞毒性T淋巴細胞的活性，具有抗腫瘤免疫作用;還可作為腫瘤H460細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和JNK信號通路的正向調(diào)節(jié)因子，抑制細胞的增殖、誘導(dǎo)及凋亡，亦可抑制肺癌、卵巢癌、前列腺癌、骨肉瘤等多種腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，這些都顯示丙泊酚具有抗腫瘤作用。
　　在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中，Wnt信號通路扮演著重要的角色。Wnt信號通路是一個復(fù)雜的蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)，至少包括三條信號通路:①

2、經(jīng)典信號通路:Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路，主要在細胞核內(nèi)激活靶基因;②細胞極性通路:Wnt/PCP通路，主要涉及氨基末端激酶和細胞骨架重構(gòu);③Wnt/Ca2+信號通路，主要調(diào)節(jié)細胞運動和細胞粘著性。它們參與細胞分化、細胞極性形成、細胞遷移和增殖等生物學過程。而經(jīng)典信號通路還參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。作為Wnt/β-catenin信號通路的重要部分，上皮型鈣粘蛋(E-cadherin)與其胞內(nèi)域相連接的β-連環(huán)蛋白(

3、β-catenin)構(gòu)成的E-鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合體(E-cadherin/catenin)是細胞間粘附分子的重要部分，在抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著極其重要的作用。
　　E-cadherin是介導(dǎo)細胞之間粘附連接的主要蛋白分子，發(fā)揮著維持細胞極性和組織結(jié)構(gòu)完整性的功能，它的抑癌作用主要是通過與β-catenin形成復(fù)合體介導(dǎo)同質(zhì)細胞之間的相互粘附，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲性，同時上皮型鈣粘蛋(E-cadherin)競爭性和β

4、-連環(huán)蛋白(β-catenin)結(jié)合，降低細胞內(nèi)游離型β-連環(huán)蛋白(β-catenin)水平，從而抑制其參與Wnt信號通路細胞增殖基因的表達。E-鈣粘蛋白復(fù)合體中無論鈣粘蛋白本身或其組分的異常變化都可能引起細胞之間的粘附能力減弱以及腫瘤細胞的運動能力增強，從而導(dǎo)致細胞容易脫離、侵襲和轉(zhuǎn)移。在沒有Wnt信號刺激的情況下，β-catenin與GSK-3組成的降解復(fù)合物結(jié)合，通過磷酸化，泛蛋白化等過程發(fā)生降解，使胞質(zhì)β-catenin保持在較

5、低水平。有研究發(fā)現(xiàn)，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的表達與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且β-catenin的表達與腫瘤組織的低分化以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及人類多種腫瘤轉(zhuǎn)移都有密切的關(guān)系，例如乳腺癌，胃癌，前列腺癌。
　　目的:
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可抑制MADB106腫瘤細胞的肺轉(zhuǎn)移，并下調(diào)轉(zhuǎn)移瘤中MTA1和Wnt1的表達，表明丙泊酚可能通過Wnt通路抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移及增殖。為進一步探討丙泊酚對腫瘤轉(zhuǎn)移的作用及機制，本研究通過

6、MADB106腫瘤細胞肺轉(zhuǎn)移大鼠模型，觀察不同劑量丙泊酚對腫瘤肺轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移瘤組織E-cadherin和β-catenin表達的影響。
　　方法:
　　1.實驗動物、藥品和試劑
　　清潔級Fischer344雄性大鼠，12～14周齡，體重200～220g(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供)。
　　鼠抗人E-cadherin單克隆抗體（即用型），鼠抗人β-catenin單克隆抗體（即用型）均購自proteinte

7、ch-武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;丙泊酚（英國阿斯利康公司，200mg/20ml，批號JK222）。
　　2.腫瘤細胞培養(yǎng)
　　MADB106腫瘤細胞系（武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供），MADB106是大鼠乳腺腺癌細胞系的一種選擇性變異，經(jīng)靜脈注入Fischer344大鼠循環(huán)系統(tǒng)后，只高選擇性地種植轉(zhuǎn)移在大鼠肺部。MADB106細胞在RPMI1640培養(yǎng)液（1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基90％，F(xiàn)BS10％，雙抗0.1％）中培養(yǎng)，放

8、于37℃，100％濕度和5％ CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并通過使用0.25％胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)。
　　3.動物分組
　　40只大鼠隨機分為4組:生理鹽水組（S組）;脂肪乳劑組（F組）;丙泊酚30mg/kg組（P1組）;丙泊酚50mg/kg組(P2組)，每組10只。1％戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射后行股靜脈置管，經(jīng)大鼠股靜脈持續(xù)泵入等容量生理鹽水，脂肪乳劑和丙泊酚，維持鼠肛溫在36-37℃，呼吸頻率約為60次/分，心率32

9、0-340次/分左右;給藥1小時后經(jīng)大鼠股靜脈注入0.5mL MADB106腫瘤細胞(2×105/ml)，拔除股靜脈置管，縫合切口，在SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)三周。
　　4.標本采集及肺部轉(zhuǎn)移瘤計數(shù)
　　3周后，1％戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后摘除眼球放血處死。固定于操作臺，行頸部正中切開并氣管插管固定。快速打開胸腔分離左右肺。將大鼠置于頭高腳低位，經(jīng)氣管插管緩慢注入4％多聚甲醛固定液，待整個肺的下3/4完全膨脹后停

10、止注入固定液，取出全肺，用生理鹽水沖洗肺表面，將全肺投入4％多聚甲醛固定液中固定24小時。將固定好的肺組織取出，放在濾紙上吸干表面的固定液后，由兩名未參與實驗人員直接計數(shù)肺表面轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目，并進行統(tǒng)計。
　　5.免疫組化染色
　　標本經(jīng)石蠟包埋，切成4μm薄片，貼于載玻片上，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水，蒸餾水洗5min;熱修復(fù)抗原后自然冷卻，PBS洗3次，5min/次;在3％H2O2孵育5-10min消除內(nèi)源性過氧化酶影響;P

11、BS洗3次，5min/次;滴加正常山羊血清封閉液室溫下20-30min，甩去多余液體;滴加一抗4℃過夜;37℃下復(fù)溫30min; PBS洗3次，5min/次;加生物素化二抗，室溫下30min; PBS洗3次，5min/次;DAB顯色;蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染;脫水、透明、封片。
　　6.指標檢測
　　6.1 計數(shù)肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量及肺表面結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移抑制率
　　大鼠飼養(yǎng)3周后處死，切除肺腫瘤組織，置于4％中性福爾馬林固定24h，

12、再經(jīng)70％的酒精脫洗后，計數(shù)肺轉(zhuǎn)移瘤的結(jié)節(jié)數(shù)，計算肺表面結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移抑制率:轉(zhuǎn)移抑制率(％)=（1-用藥組平均轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)/對照組平均轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)）×100％。之后常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片作免疫組化標記。
　　6.2 結(jié)果判定
　　β-catenin與E-cadherin在正常肺組織，定位于細胞膜，免疫組化陽性反應(yīng)為棕黃色或黃色細顆粒狀著色。肺轉(zhuǎn)移瘤組織中則主要表現(xiàn)出不同程度的細胞質(zhì)和或細胞核顯色，而細胞膜的顯色減少，免疫組化陽

13、性反應(yīng)為棕黃色或黃色細顆粒狀。光鏡10×40倍下，于細支氣管或肺泡上皮陽性染色處隨機選擇5個視野，用Olympus DP70CCD采集圖像。采用Image-pro plus10.0免疫組化彩色圖像分析系統(tǒng)對結(jié)果進行半定量分析，以圖片中一個陽性細胞為基礎(chǔ)，測定、分析整幅圖片的陽性細胞平均光密度(OD)值。
　　7.統(tǒng)計學處理
　　統(tǒng)計學分析采SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料，E-cadherin和β-catenin在各組間的

14、表達以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson法，以p＜0.05認為具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目及轉(zhuǎn)移抑制率
　　S組與F組相比，肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目無顯著差異(p＞0.05);與S組相比，P1組和P2組肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目減少(p＜0.01)，轉(zhuǎn)移抑制率增加(p＜0.01)。P2組和P1組相比，肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目減少(p＜0.01)，轉(zhuǎn)移抑制率增加(p＜0.01)。F組

15、、P1組和P2組肺表面結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移抑制率分別為9.63％，48.15％，68.89％，P2組明顯高于F組。肺轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)與丙泊酚劑量負相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)為-0.879(p＜0.01)。
　　2.轉(zhuǎn)移瘤中E-cadhrin，β-catenin的表達
　　E-cadherin的表達，S組和F組腫瘤組織染色深，數(shù)量多，平均光密度值的差異無統(tǒng)計學意義，兩組E-cadhrin的表達無顯著差異(p＞0.05);與生理鹽水組（Sali

16、ne組）相比，P1組和P2組中的腫瘤組織染色淺，數(shù)量少，平均光密度值減少，E-cadhrin蛋白表達減少，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05); P2組和P1組相比，腫瘤組織染色淺，數(shù)量少，平均光密度值減少，E-cadherin蛋白表達減少，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。E-cadherin的表達與丙泊酚劑量負相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)分別為-0.755(p＜0.01)。
　　β-catenin的表達，S組和F組腫瘤組織染色深，

17、數(shù)量多，平均光密度值的差異無統(tǒng)計學意義，兩組β-catenin的表達無顯著差異(p＞0.05);與生理鹽水組（Saline組）相比，P1組和P2組中的腫瘤組織染色淺，數(shù)量少，平均光密度值減少，β-catenin蛋白表達減少，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，P2組和P1組相比，腫瘤組織染色淺，數(shù)量少，平均光密度值減少，β-catenin蛋白表達減少，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。β-catenin的表達與丙泊酚劑量負相關(guān)，Pears