利用Tet-on系統(tǒng)誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)對肝癌作用的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、強(qiáng)力霉素調(diào)控表達(dá)的人肝癌HepG2Tet-on細(xì)胞系的建立。 目的：構(gòu)建可以用強(qiáng)力霉素調(diào)控表達(dá)的人肝癌HepG2Tet-on細(xì)胞系。 方法：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pWHE146質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人肝癌HepG2細(xì)胞中，G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞克隆；單克隆分別擴(kuò)增后，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pTRE-hyg-luc質(zhì)粒，強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)表達(dá)后，檢測熒光素酶表達(dá)活性，挑選出受強(qiáng)力霉素調(diào)控的低背景、高表達(dá)的HepG2Tet-on細(xì)胞株。 結(jié)果

2、：成功構(gòu)建了一株受強(qiáng)力霉素調(diào)控的高表達(dá)低背景的HepG2Tet-on細(xì)胞株。 結(jié)論：HepG2Tet-on細(xì)胞株可用于外源基因的真核調(diào)控高表達(dá),為研究真核基因功能提供了一種有力的實(shí)驗(yàn)手段。 第二部分、強(qiáng)力霉素調(diào)控HIF-1α表達(dá)的人肝癌HepG2Tet-on-HIF-1α雙穩(wěn)細(xì)胞系構(gòu)建。 目的：建立強(qiáng)力霉素調(diào)控HIF-1α表達(dá)的人肝癌HepG2Tet-on-HIF-1α雙穩(wěn)細(xì)胞系。 方法：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重

3、組質(zhì)粒pTRE-HIF-1α轉(zhuǎn)染入HepG2Tet-on細(xì)胞株，潮霉素（hyg）篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞克隆HepG2Tet-on-HIF-1α；用強(qiáng)力霉素（1μg/ml）誘導(dǎo)后，用RT-PCR和Western-blot檢測HIF-1α表達(dá)。 結(jié)果：強(qiáng)力霉素（1μg/ml）可誘導(dǎo)HepG2Tet-on-HIF-1α細(xì)胞HIF-1α mRNA（5.899±2.176倍）和蛋白表達(dá)增加（2.179±0.742倍）。 結(jié)論：成功建立

4、強(qiáng)力霉素調(diào)控HIF-1α表達(dá)的人肝癌HepG2Tet-on-HIF-1α雙穩(wěn)細(xì)胞系，為深入研究HIF-1α在肝癌細(xì)胞中的作用提供了有力的實(shí)驗(yàn)手段。 第三部分、調(diào)控HIF-1α表達(dá)對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響。 目的：探討體外常氧下，誘導(dǎo)表達(dá)HIF-1α對HepG2細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響。 方法：常氧下，四甲基偶氮唑鹽法檢測缺氧誘導(dǎo)因子1α對細(xì)胞增殖、黏附能力的影響，Transwell法檢測其對侵襲

5、能力的影響。 結(jié)果：增殖實(shí)驗(yàn)中，Dox（＋）組與Dox（-）組各時(shí)段A490nm 值無差異(P＞0.05)；黏附實(shí)驗(yàn)中，Dox（＋）組的A490nm 值明顯高于Dox（-）組(P=0.008)；Dox（＋）組侵襲細(xì)胞數(shù)（37.611±8.424）明顯高于Dox（-）組（25.333±8.117）(P＜0.001)。 結(jié)論：常氧下，缺氧誘導(dǎo)因子1α不影響HepG2細(xì)胞的增殖，但明顯增加其黏附和侵襲能力。 第四部分、

6、強(qiáng)力霉素調(diào)控HIF-1α表達(dá)的裸鼠肝癌皮下移植瘤模型的建立。 目的：建立可以由強(qiáng)力霉素（Dox）誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)的裸鼠肝癌皮下移植瘤模型。 方法：注射法建立裸鼠肝癌HepG2Tet-on-HIF-1α細(xì)胞皮下移植瘤模型；口服強(qiáng)力霉素7周，RT-PCR和Western-blot檢測皮下移植瘤中HIF-1α表達(dá)。 結(jié)果：與Dox（－）組相比，Dox（＋）組裸鼠HepG2Tet-on-HIF-1α細(xì)胞皮下移植瘤中H

7、IF－1αmRNA（4.303±1.004倍）和蛋白（1.666±0.079倍）表達(dá)增加。 結(jié)論：口服強(qiáng)力霉素可以有效地誘導(dǎo)裸鼠HepG2Tet-on-HIF-1α細(xì)胞皮下移植瘤中HIF－1αmRNA和蛋白表達(dá)增加，為體內(nèi)研究HIF－1α對肝癌的作用提供了有效的實(shí)驗(yàn)手段。 第五部分、強(qiáng)力霉素調(diào)控HIF-1α表達(dá)對裸鼠肝癌皮下移植瘤的作用。 目的：探討體內(nèi)調(diào)控表達(dá)HIF-1α對裸鼠肝癌皮下移植瘤生長和凋亡的影響。

8、 方法：強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)裸鼠肝癌HepG2Tet-on-HIF-1α細(xì)胞皮下移植瘤缺氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)；觀察上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)對裸鼠皮下移植瘤生長的影響；Tunel 法檢測兩組皮下移植瘤原位凋亡的情況；免疫組化和western blot檢測兩組皮下移植瘤中血管生成情況。 結(jié)果：Dox（＋）組在腫瘤體積、重量、生長速度上都明顯超過Dox（-）組，腫瘤內(nèi)壞死面積明顯小于Dox（-）組；同Dox（-）組相比，Dox（＋）組裸鼠