內質網滯留型抗TfR胞內抗體的構建及其對腫瘤細胞增殖與凋亡的影響研究.pdf

1、鐵是細胞生長增殖、代謝的必需元素，轉鐵蛋白受體(TfR)介導的胞吞作用是細胞攝取鐵的主要途徑。腫瘤細胞由于增殖生長旺盛，對鐵的需求高，所以腫瘤細胞有比正常細胞更多的與鐵代謝相關受體的表達和對鐵的攝取率，使得腫瘤細胞對鐵剝奪治療更敏感。研究證明鐵剝奪可在體內外抑制腫瘤細胞生長，誘導其凋亡。
　　 胞內抗體技術是指應用基因重組技術在非淋巴細胞內表達具有生物活性的抗體，并通過對抗體分子進行適當修飾，使之定向分布于細胞核、細胞漿或某些細

2、胞器中，從而特異性干擾或阻斷分布于該部位的某些生物大分子的活性或加工、分泌過程，引起細胞的一系列生物過程發(fā)生改變。在腫瘤基因治療領域，胞內抗體已應用于阻斷、下調與其增殖密切相關的高表達受體或其他癌相關蛋白，如erbB-2、EGFR、VEGFR、葉酸受體等。胞內抗體的發(fā)展開辟了一條通過抗原中和進行表型或功能敲除的新途徑。
　　 目的：本研究擬在前期研究基礎上，構建表達內質網滯留型抗TfR的胞內抗體，通過抗體與胞內TfR相互作用抑制

3、腫瘤細胞膜TfR的高表達，減少腫瘤細胞鐵的轉運和吸收，從而抑制腫瘤細胞生長，誘導其凋亡。探索通過抗TfR胞內抗體達到腫瘤細胞鐵剝奪抗腫瘤的可行性。
　　 方法：利用兩步法加端PCR技術在抗TfR單鏈抗體 cDNA兩端引入信號肽序列、HA-tag序列及KDEL滯留信號，構建內質網滯留型抗TfR單鏈抗體真核表達載體pIRES2-scFv-HAK-EGFP，同時設無滯留信號的表達載體pIRES2-scFv-HA-EGFP作為對照；采用

4、脂質體將重組體轉染乳腺癌細胞株MCF-7；通過RT-PCR、western blot、激光共聚焦顯微術以及免疫電鏡檢測scFv基因表達及亞細胞定位；間接免疫熒光染色流式細胞術(FCM)檢測腫瘤細胞表面TfR表達，real-time PCR檢測鐵蛋白、轉鐵蛋白受體mRNA相對水平，了解轉染細胞鐵代謝狀況；PI染色FCM分析細胞周期，MTT法檢測細胞增殖與活力，熒光染色觀察細胞凋亡。
　　 結果：①表達載體通過酶切電泳鑒定可見目的基

5、因條帶，測序結果證明含有信號肽序列、HA-tag序列、KDEL滯留信號以及TfR-scFv目的基因，表明內質網定位表達的抗TfR胞內抗體真核表達載體構建成功；② RT-PCR和western blot檢測可見有scFv相應的基因和蛋白質條帶；③激光共聚焦顯微術以及免疫電鏡觀察可見細胞內質網有scFv的定位表達；④間接免疫熒光FCM結果顯示，轉染pIRES2-scFv-HAK-EGFP的腫瘤細胞表面TfR的表達顯著降低，提示胞內表達的Tf

6、R-scFv能與胞內轉鐵蛋白受體結合，抑制其向細胞表面轉運；而real time PCR檢測結果表明轉鐵蛋白受體mRNA水平顯著升高，提示有腫瘤細胞鐵吸收減少；⑤ PI染色FCM檢測細胞周期顯示轉染胞內抗體基因scFv-HAK的腫瘤細胞有明顯G0/G1期阻滯和細胞凋亡，細胞增殖和活力檢測有明顯的腫瘤細胞生長抑制。
　　 結論：首次提出并證明通過內質網滯留型抗轉鐵蛋白受體胞內抗體可以成功下調腫瘤細胞表面轉鐵蛋白受體的高表達，減少腫