癌性胸腹水對抗癌藥物敏感性研究及實時熒光定量端粒酶活性藥敏試驗方法的建立.pdf

1、背景與目的：惡性腫瘤已成為威脅人類健康的第一殺手，且在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢。化療仍然是目前惡性腫瘤治療的主要手段之一。由于腫瘤組織具有異質(zhì)性，不同類型腫瘤對抗癌藥物的敏感性不同，即使是同一類型的腫瘤，由于患者遺傳背景不同，對抗癌藥物的敏感性也不盡相同。而臨床上化療方案的選擇大多憑醫(yī)師經(jīng)驗，同一化療方案固定不變的應(yīng)用于許多患者，忽視個體差異，使總體療效不佳。
　　近年來，隨著惡性腫瘤藥物敏感性試驗（簡稱“藥敏試驗

2、”）的迅速發(fā)展，以藥敏試驗結(jié)果為基礎(chǔ)的個體化治療對臨床抗癌藥物的篩選，聯(lián)合化療方案的制定和預(yù)測患者生存期發(fā)揮著重要作用。尤其是對于那些癌癥晚期不能手術(shù)且合并大量胸腹水的患者，可以無菌穿刺獲得胸腹水標(biāo)本，分離提取其中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行藥敏試驗，篩選出高度敏感抗癌藥物，對癌癥患者進(jìn)行個體化治療，可以顯著提高化療效果，減少耐藥和不良反應(yīng)的發(fā)生。[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，內(nèi)鹽]（MT

3、S）比色法由于操作簡便，無需特殊設(shè)備，可簡單迅速分析大量樣品，成本低廉，因此廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤藥敏試驗。但其也存在一定的局限性，由于MTS比色法的原理是：在偶聯(lián)劑吩嗪硫酸二甲酯（PMS）存在的條件下，MTS可被活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原成水溶性的深棕色的甲瓚產(chǎn)物，其不能排除腫瘤組織中正常細(xì)胞對其藥敏試驗結(jié)果造成的影響，因此，建立能區(qū)分開抗癌藥物對正常細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，特異性強(qiáng)的腫瘤藥敏試驗方法成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱點。由

4、于端粒酶活性幾乎在所有的惡性腫瘤細(xì)胞高表達(dá)，而在正常體細(xì)胞中極少表達(dá)，因此端粒酶活性藥敏試驗法可以克服上述MTS比色法的不足，其原理是：檢測抗癌藥物作用前后惡性腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性，從而反映抗癌藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷程度。由于國內(nèi)外相關(guān)報道較少，其在臨床腫瘤藥敏試驗中的應(yīng)用還有待進(jìn)一步探索驗證。
　　本研究第一部分將采用密度梯度離心法從55例患者無菌穿刺的癌性胸腹水中提取腫瘤細(xì)胞，再采用MTS比色法檢測其對9種常用抗癌藥物的體外敏感

5、性，為癌癥晚期合并胸腹水患者選擇最佳化療方案及實現(xiàn)個體化治療提供依據(jù)；第二部分將建立一種新型的端粒酶活性藥敏試驗方法，即實時熒光定量端粒重復(fù)序列擴(kuò)增（RQ-TRAP）法，并探索其應(yīng)用于體外藥敏試驗中的可行性及與MTS比色法在預(yù)測腫瘤細(xì)胞對抗癌藥物敏感性之間的差異，從而為其作為腫瘤藥敏試驗的新方法應(yīng)用于臨床腫瘤治療提供理論依據(jù)。
　　第一部分 MTS比色法檢測癌性胸腹水對9種常用抗癌藥物的體外敏感性研究
　　方法：無菌穿刺收集

6、2011年10月至2012年10月在廣州醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院住院的55例腫瘤患者新鮮癌性胸腹水標(biāo)本。采用密度梯度離心法分離提取41例患者癌性胸水和14例患者癌性腹水中的腫瘤細(xì)胞，并采用HE染色進(jìn)行鑒別。再采用新型四氮唑比色（MTS）法檢測癌性胸水對多西他賽（DOC）、氟脲嘧啶（5-FU）、博來霉素（BLM）、順鉑（CDDP）、長春瑞濱（VNR）、奈達(dá)鉑（NDP）、吉西他濱（GEM）、培美曲塞（MTA）和癌性腹水對DOC、5-FU、BLM、

7、CDDP、VNR、NDP、GEM、奧沙利鉑（L-OHP）的敏感性，以及8種抗癌藥物對41例癌性胸水中35例非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）胸水細(xì)胞的抑制作用；并觀察在各抗癌藥物濃度為1倍的血漿峰值濃度（1×PPC）時，接受抗癌藥物治療的癌癥患者的臨床療效與采用MTS比色法進(jìn)行體外藥敏試驗所得結(jié)果之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：癌性胸腹水中的腫瘤細(xì)胞對抗癌藥物的敏感性與藥物的濃度呈正相關(guān)，在藥物濃度為1×PPC時，癌性胸水對抗癌藥物的敏感性依次

8、為：NDP>CDDP>VNR>GEM>5-FU>MTA>DOC>BLM，癌性腹水對抗癌藥物的敏感性依次為：NDP>L-OHP>CDDP>VNR=GEM>5-FU>BLM>DOC；在藥物濃度為5×PPC時，癌性胸水對抗癌藥物的敏感性依次為：NDP=CDDP>GEM>VNR>5-FU>DOC>MTA>BLM，癌性腹水對抗癌藥物的敏感性依次為：NDP=CDDP>L-OHP>VNR>GEM>5-FU>BLM>DOC。
　　8種抗癌藥物對N

9、SCLC胸水細(xì)胞的抑制作用具有顯著性差異（P<0.001）。在濃度為1×PPC時，IR比較具有顯著性差異的有NDP、CDDP>GEM>VNR>5-FU、DOC、BLM、MTA，其他各藥物之間相比無顯著性差異；在濃度為5×PPC時，IR比較具有顯著性差異的有NDP、CDDP>GEM>VNR、5-FU>BLM>DOC、MTA，其他各藥之間無顯著性差異。
　　在抗癌藥物濃度為1×PPC時，接受化療的癌癥患者采用MTS比色法進(jìn)行體外藥敏試

10、驗所得結(jié)果與其臨床療效具有良好的相關(guān)性（P<0.05），MTS比色法評估體內(nèi)化療效果的總預(yù)測準(zhǔn)確率可達(dá)75.7％，敏感性為87.5%，特異性為53.8%，陽性預(yù)測值為77.8%，陰性預(yù)測值為70.0%。
　　結(jié)論：MTS比色法作為一種簡便、快速、安全的體外藥敏試驗常用方法，可為癌癥晚期合并胸腹水患者的選擇合適的化療方案、實現(xiàn)個體化治療提供依據(jù)；對于癌癥晚期合并胸腹水患者的化療方案可首選鉑類化合物，其次為GEM和VNR；給藥劑量可以

11、根據(jù)藥敏試驗結(jié)果進(jìn)行調(diào)整，從而提高治療效果，減少毒副作用。
　　第二部分實時熒光定量端粒酶活性藥敏試驗方法的建立
　　方法：選擇人宮頸癌細(xì)胞株（Hela）和正常人胚肺成纖維細(xì)胞株（MRC-5）作為試驗?zāi)Ｐ汀Ｈ?shù)生長期的Hela及MRC-5細(xì)胞，采用CHAPS細(xì)胞裂解液將其裂解，提取端粒酶RNA，將Hela細(xì)胞端粒酶提取液以10倍等比稀釋，采用實時熒光定量端粒重復(fù)序列擴(kuò)增（RQ-TRAP）法檢測Hela及MRC-5細(xì)胞的端粒

12、酶活性，并建立Hela細(xì)胞端粒酶活性隨其數(shù)量變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　以100個Hela細(xì)胞所提取的端粒酶RNA為基準(zhǔn)，與不同數(shù)量的MRC-5細(xì)胞所提取的端粒酶RNA以1:1，1:2，1:5，1:10，1:50比例混合，采用RQ-TRAP法檢測混合后的端粒酶活性，并與100個Hela細(xì)胞端粒酶活性進(jìn)行比較，觀察混入不同數(shù)量的MRC-5細(xì)胞對Hela細(xì)胞端粒酶活性的影響。
　　取處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，待其與順鉑（CDDP）

13、、多西他賽（DOC）作用24 h后，采用MTS比色法測定CDDP、DOC半數(shù)抑制濃度（IC50）。另取對數(shù)生長期的Hela及 MRC-5細(xì)胞，將其以細(xì)胞數(shù)量1:1進(jìn)行混合設(shè)為 Hela細(xì)胞與MRC-5混合細(xì)胞組，另設(shè)Hela細(xì)胞組及MRC-5細(xì)胞組。抗癌藥物CDDP與DOC的濃度分別為其24 h對Hela細(xì)胞的IC50。待各細(xì)胞組與CDDP、DOC作用24 h后，分別采用MTS比色法及RQ-TRAP法檢測各細(xì)胞組對CDDP、DOC的敏感

14、性，觀察以上兩種方法在預(yù)測各細(xì)胞組對抗癌藥物敏感性中的差異。
　　結(jié)果：Hela細(xì)胞的端粒酶活性是MRC-5細(xì)胞的851.06倍，可見MRC-5細(xì)胞端粒酶活性表達(dá)顯著低于Hela細(xì)胞。100個Hela細(xì)胞所提取RNA分別與100、200、500、1000、5000個MRC-5細(xì)胞所提取RNA混合后的端粒酶活性與100個Hela細(xì)胞組的端粒酶活性比較結(jié)果在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異（P>0.05），不同數(shù)量的MRC-5細(xì)胞混入對Hela細(xì)

15、胞端粒酶活性無顯著性影響。
　　CDDP、DOC對Hela細(xì)胞24 h的IC50值分別為53.384μg/ml和150.859μg/ml。MRC-5細(xì)胞組端粒酶活性表達(dá)量很低，幾乎檢測不到，表明端粒酶活性在正常細(xì)胞中低表達(dá)，而在惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。對于Hela細(xì)胞組，采用RQ-TRAP法所測得的CDDP、DOC抑制率均比采用MTS比色法高，其中CDDP組的比較結(jié)果在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異（P<0.05）；對于Hela與MRC-5混

16、合細(xì)胞組，采用RQ-TRAP法所測得的CDDP、DOC抑制率均比采用MTS比色法高，且CDDP、DOC組的比較結(jié)果在統(tǒng)計學(xué)上均具有顯著性差異（P<0.001）。采用MTS比色法所測得的CDDP、DOC對混合細(xì)胞組的抑制率顯著低于Hela細(xì)胞組的抑制率（P<0.001）。而采用RQ-TRAP法所測得的CDDP、DOC對混合細(xì)胞組的抑制率與其對Hela細(xì)胞組的抑制率在統(tǒng)計學(xué)上均無顯著性差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：本研究建立了實時

17、熒光定量端粒重復(fù)序列擴(kuò)增（RQ-TRAP）法。采用該法檢測抗癌藥物作用前后腫瘤細(xì)胞端粒酶活性變化，可以反映腫瘤細(xì)胞對抗癌藥物的敏感性。在體外藥敏試驗中，RQ-TRAP法靈敏度及特異性均顯著高于MTS比色法，主要是由于MTS比色法不能區(qū)分開抗癌藥物對惡性腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞殺傷作用，而RQ-TRAP法只檢測存在于惡性腫瘤細(xì)胞中的端粒酶活性，因此可以排除混入的成纖維細(xì)胞對藥敏試驗結(jié)果的影響。RQ-TRAP法作為藥敏試驗的新方法，可快速篩選出高