縫隙連接及連接蛋白43在胰島素調(diào)節(jié)大鼠血管平滑肌細(xì)胞收縮反應(yīng)性中的變化機(jī)制及藥物干預(yù)研究.pdf

1、研究背景:
　　冠狀動脈痙攣是急性冠脈綜合癥、變異型心絞痛、冠狀動脈微血管性心絞痛以及危及生命心律失常等多種心血管疾病的重要病因，并且急性心梗病人中激發(fā)性冠狀動脈痙攣的發(fā)生是其預(yù)后不良的預(yù)測因子[1]。即使在現(xiàn)今因鈣拮抗劑廣泛使用并且可能引起冠狀動脈痙攣的發(fā)生率逐漸降低的西方國家，對于急性胸痛的相對年輕患者仍應(yīng)高度警惕痙攣性心絞痛的發(fā)生[2]。2008年公布的CASPAR試驗(yàn)結(jié)果表明超過四分之一的冠脈痙攣患者沒有明顯的冠脈血管阻塞

2、，其中約百分之五十的患者存在明確的冠狀動脈痙攣[3]。從Egashira[4][5]等發(fā)現(xiàn)在冠狀動脈痙攣部位并未發(fā)現(xiàn)NO的減少，從而推測存在其他機(jī)制如磷脂酶C活性增高引起血管平滑肌細(xì)胞的高反應(yīng)性而誘發(fā)變異型心絞痛的發(fā)生，人們對冠狀動脈痙攣的機(jī)制研究逐漸從內(nèi)皮功能不全轉(zhuǎn)移到血管平滑肌細(xì)胞高反應(yīng)性及其他[6]。
　　血管平滑肌細(xì)胞是調(diào)整血管張力的最終效應(yīng)器官，血管平滑肌反應(yīng)性大小與自身細(xì)胞間傳遞及依賴內(nèi)皮調(diào)節(jié)有關(guān)。但血管壁平滑肌細(xì)胞間

3、如何協(xié)同反應(yīng)仍未完全明確?？p隙連接(gap junction，GJ)是存在于相鄰細(xì)胞間的一種膜通道結(jié)構(gòu)，作為一種直接通訊參與了細(xì)胞間的物質(zhì)和信息的交流，存在于內(nèi)皮細(xì)胞間、內(nèi)皮和血管平滑肌細(xì)胞間以及血管平滑肌細(xì)胞間，對維持血管張力有重要作用。GJ的基本組成單位是是連接蛋白(Connexin，Cx)。在血管平滑肌系統(tǒng)以表達(dá)Cx43、Cx40、Cx37、Cx45為主，尤其在大的彈性動脈中層以表達(dá)Cx43為主，而在肌性動脈則以Cx40、Cx37

4、、Cx45為主[7][8]。當(dāng)機(jī)體受到高血壓、動脈粥樣硬化、缺血缺氧等所致細(xì)胞損傷或增生后，通過改變連接蛋白的表達(dá)，可以明顯改變縫隙連接的功能，對血管壁的細(xì)胞間交流進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)從而影響血管的舒縮功能，使機(jī)體對不同刺激做出及時(shí)、有效地應(yīng)答，因此可能參與血管痙攣性疾病的發(fā)生[9][10]。Cx43似乎是機(jī)械變化的早期感受器，平滑肌細(xì)胞通過Cx43對增加的跨膜壓作出相應(yīng)的彈性和收縮性改變。研究表明Cx43的磷酸化與去磷酸化對縫隙連接通道功能有

5、非常重要的影響。
　　胰島素抵抗作為代謝綜合癥的中心環(huán)節(jié)，貫穿糖尿病發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過程，在此過程中先出現(xiàn)高胰島素血癥等炎癥性、氧化應(yīng)激性改變之后逐漸出現(xiàn)高血壓、高血糖等相關(guān)性疾病(11)(12)。有研究表明胰島素抵抗伴有高胰島素血癥是冠狀動脈痙攣的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[13]。冠狀動脈痙攣的發(fā)生與內(nèi)皮功能不全、血管平滑肌反應(yīng)性增高、氧化應(yīng)激、離子失衡等有關(guān)。而IR作為一種致炎狀態(tài)，與內(nèi)皮功能損害、血管反應(yīng)性、氧化應(yīng)激等同樣密切相關(guān)。但有研

6、究表明胰島素可以緩解冠狀動脈痙攣并增加血流而改善血管痙攣患者的心絞痛癥狀。而高胰島素水平又能促使內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ET-1而加重血管痙攣。不同濃度的胰島素對彈力血管的舒縮功能改變產(chǎn)生的作用不同，而且在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下不同部位的血管反應(yīng)性也發(fā)生不同變化[14][15]。究竟是什么原因?qū)е逻@種病理生理差異性的改變，目前尚未知曉。研究顯示氧化磷脂OxPAPC能夠改變血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞中Cx37、Cx43的表達(dá)，與其增加Cx43T265位點(diǎn)磷酸

7、化有關(guān)，并降低肌內(nèi)皮縫隙連接功能，推測可能與高血脂、高血壓及代謝綜合征等引起的血管功能改變有關(guān)[16]。而RhoA-ROCK通路作為血管收縮的一個(gè)分子開關(guān)其激活與高血壓、糖尿病及衰老狀態(tài)下活性氧介導(dǎo)的血管平滑肌收縮功能改變有關(guān)[17]。目前氧化應(yīng)激是否通過RhoA-ROCK通路對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下血管平滑肌細(xì)胞中縫隙連接蛋白的表達(dá)及縫隙連接間通訊交流產(chǎn)生影響的相關(guān)報(bào)道較少。
　　本課題組先期研究顯示通心絡(luò)通過多種途徑可以抑制冠狀動脈

8、痙攣。其作用機(jī)制可能為抑制PKC活性，減少氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，促進(jìn)NO的產(chǎn)生，減少抗氧化物質(zhì)的消耗，抑制ET-1所致的病理狀態(tài);抑制Rho激酶表達(dá)、活性的增加從而持續(xù)有效的抑制血管痙攣的作用[18]）。通心絡(luò)能否影響胰島素抵抗引起血管損傷時(shí)的異?？p隙連接蛋白表達(dá)從而改變細(xì)胞間通訊交流未見報(bào)道。同時(shí)阿托伐他汀鈣能夠降低血管平滑肌細(xì)胞中Cx43的表達(dá)而抑制細(xì)胞增殖，但對慢性高濃度胰島素培養(yǎng)下VSMCs中Cx43及磷酸化的影響尚未見報(bào)道，其中具體

9、機(jī)制仍需進(jìn)一步探求。
　　本課題分別應(yīng)用不同濃度胰島素、高糖與高胰島素與大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)，并應(yīng)用高濃度胰島素予急性刺激，運(yùn)用蛋白印記技術(shù)和共聚焦顯微鏡，分析縫隙連接及連接蛋白的表達(dá)變化并觀察血管平滑肌細(xì)胞對5-HT的收縮反應(yīng)性;觀察平滑肌細(xì)胞內(nèi)H2O2對縫隙連接及連接蛋白的影響及可能作用通路;研究他汀類藥物及通心絡(luò)醇提物改變縫隙連接及連接蛋白表達(dá)的可能機(jī)制，旨在闡明胰島素對縫隙連接及連接蛋白參與血管平滑肌細(xì)胞收縮反應(yīng)性的

10、機(jī)制，開創(chuàng)防治冠脈痙攣藥物作用新靶點(diǎn)，具有重要的理論和臨床意義。
　　研究方法:
　　1、模擬不同胰島素環(huán)境培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞觀察縫隙連接及連接蛋白43并磷酸化位點(diǎn)S368的變化。培養(yǎng)原代血管平滑肌細(xì)胞，取3-5代細(xì)胞分別在正常葡萄糖組、生理濃度胰島素組、高濃度胰島素組、高濃度胰島素+高葡萄糖組培養(yǎng)24小時(shí)，之后予急性高濃度胰島素刺激30分鐘。采用共聚焦熒光顯微鏡觀察5-HT作用下血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)、鈣濃度變化，熒光漂白恢復(fù)

11、試驗(yàn)測定縫隙連接功能，western blot測定Cx43及Cx43-S368蛋白表達(dá)。
　　2、高胰島素環(huán)境培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞分析活性氧簇清除劑catalase、ROCK阻斷劑Y-27632對縫隙連接及連接蛋白的影響，并探討其中的關(guān)聯(lián)。培養(yǎng)原代血管平滑肌細(xì)胞，取3-5代細(xì)胞分別在予catalase、Y-27632及二者共預(yù)處理后再分別與高濃度胰島素共培養(yǎng)30min或24小時(shí)。采用共聚焦熒光顯微鏡觀察5-HT作用下熒光漂白恢復(fù)試驗(yàn)

12、測定縫隙連接功能，western blot測定Cx43及P-Cx43-S368蛋白表達(dá)?；瘜W(xué)發(fā)光法及G-lisa法測定H2O2水平和RhoA活性變化。
　　3、慢性高胰島素培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞，分析阿托伐他汀鈣、通心絡(luò)醇提物對縫隙連接及Cx43及P-Cx43-S368的影響，同時(shí)測定H2O2、 RhoA活性變化，探討阿托伐他汀鈣及通心絡(luò)的可能作用機(jī)制。
　　研究結(jié)果:
　　1、不同胰島素環(huán)境與血管平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)

13、:①1nm/l、l00nm/l胰島素及100nm/l胰島素+25mmol/l葡萄糖處理細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡下觀察VSMCs在5-羥色胺作用下收縮情況:A:細(xì)胞形態(tài)面積:生理濃度胰島素組細(xì)胞縮小變化百分率（5.72±0.14）、急性胰島素作用VSMCs面積縮小率(5.59±0.89)小于高胰島素組（13.89±0.98）及高胰島素+高糖組（14.78±1.02），P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B:Ca2+內(nèi)流:生理胰島素組鈣熒光強(qiáng)度增加受

14、抑制，而高胰島素組及高胰島素+高糖組增加，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;急性高濃度胰島素作用VSMCs，鈣熒光強(qiáng)度增加但低于慢性胰島素作用組，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;②激光共聚焦顯微鏡下測定FRAP:在高胰島素作用下最大熒光恢復(fù)比例、熒光恢復(fù)速率低于對照組和生理胰島素組，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;在5-HT作用下，對照組、生理胰島素組、急性高胰島素組GJIC增加不顯著或降低，而高胰島素組及高胰島素+高糖組明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;③wes

15、tern檢測Cx43及P-Cx43-S368蛋白表達(dá):在胰島素作用下各組均有P-Cx43-S368表達(dá)，隨著濃度增加及時(shí)間延長而增加;急性胰島素作用VSMCs，Cx43表達(dá)降低，而隨著作用時(shí)間逐漸延長至24小時(shí)，Cx43表達(dá)增加;慢性胰島素孵育VSMCs后再予急性胰島素刺激，P-Cx43-S368表達(dá)繼續(xù)增加，而Cx43增加不顯著，與慢性組比較，前者有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，后者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、高胰島素與VSMCs長時(shí)間共培養(yǎng)前經(jīng)ca

16、talase(2000u/ml)、Y-27632(10umol/l)預(yù)處理30min后:①FRAP檢測受抑制的GJIC恢復(fù)，與處理組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;在5-HT作用下，GJIC增加不顯著，較control組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;western檢測Cx43及P-Cx43-S368蛋白表達(dá)均明顯降低，與胰島素處理組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;②G-lisa檢測高胰島素處理細(xì)胞24h后，細(xì)胞RhoA活性增高，較control組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;預(yù)處理后RhoA活性

17、下降，與處理組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;③H2O2檢測試劑盒檢測100nmol/l insulin處理細(xì)胞24h后H2O2水平，與control組比較，H2O2增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(108.1±8.9 VS18.6±4.2，P＜0.01);預(yù)處理后H2O2水平下降，較處理組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高胰島素與VSMC短時(shí)間共培養(yǎng)前經(jīng)catalase(2000u/ml)、Y-27632(10umol/l)預(yù)處理后:①FRAP檢測受抑制的GJIC恢復(fù)，與處理組

18、比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;在5-HT作用下，GJIC抑制不顯著，較control組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;western檢測P-Cx43-S368表達(dá)明顯降低，與處理組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而Cx43表達(dá)恢復(fù)較comtrol組無差異;②G-lisa檢測高胰島素處理細(xì)胞30min后，細(xì)胞RhoA活性降低，較control組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;catalase預(yù)處理后RhoA活性較control組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;③H2O2檢測試劑盒檢測100nmol/l inslin處

19、理細(xì)胞30min后H2O2水平，與control比較，H2O2增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(48.1±7.4VS18.4±3.2，P＜0.01)，預(yù)處理后H2O2水平降低，與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、高胰島素與VSMC長時(shí)間共培養(yǎng)前經(jīng)atrovastatin(10umol/l)、通心絡(luò)醇提物(5mg/ml)預(yù)處理20min后:①FRAP檢測抑制的GJIC恢復(fù)，與胰島素處理組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;western檢測Cx43及P-Cx43-S

20、368蛋白表達(dá)均明顯降低，與處理組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;②G-lisa檢測細(xì)胞RhoA活性降低，較胰島素處理組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;③H2O2檢測試劑盒檢測H2O2水平，與胰島素處理組比較，H2O2降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(atrovastatin組50.5±4.8VS108.1±8.9，P＜0.01;TXL組58.1±10.2VS108.1±8.9，P＜0.01);atrovastatin組與GGPP共孵育后atrovastatin作用均被逆轉(zhuǎn)。

21、>　　結(jié)論:
　　1、高濃度胰島素影響大鼠血管平滑肌細(xì)胞縫隙連接通訊對5-羥色胺反應(yīng)性和縫隙連接蛋白43表達(dá)，其變化呈雙相特征，即高濃度胰島素短時(shí)間處理細(xì)胞，GJIC反應(yīng)性及Cx43下調(diào)，長時(shí)間處理細(xì)胞則反之;
　　2、胰島素可引起縫隙連接蛋白S368位點(diǎn)磷酸化。
　　3、高濃度胰島素通過H2O2調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞RhoA活性，其調(diào)節(jié)具有雙相特征;即高濃度胰島素短時(shí)間處理細(xì)胞下調(diào)RhoA活性，長時(shí)間處理細(xì)胞則反之;并影

22、響縫隙連接通訊對5-羥色胺反應(yīng)性和縫隙連接蛋白43表達(dá);
　　4、阿托伐他汀鈣通過異戊二烯途徑抑制慢性高濃度胰島素誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞Cx43及P-Cx43-S368高表達(dá)，恢復(fù)異常GJIC，是其心血管保護(hù)作用的多效性又一體現(xiàn);通心絡(luò)醇提物具有同樣作用，可能與其抗氧化、抑制RhoA活性有關(guān);
　　5、生理濃度胰島素及急性高濃度胰島素抑制血管平滑肌細(xì)胞GJIC對5-HT高反應(yīng)性，是其生物學(xué)效應(yīng)，是氧化應(yīng)激的保護(hù)作用;而慢性高濃