小型豬自體移植腎灌注短效Caspase-3小干擾RNA冷保存導(dǎo)致腎損傷加劇的機(jī)制初探.pdf

1、目的:在小型豬自體腎移植模型中探究短效Caspase-3小干擾RNA(smallinterfering ribonucleic acid，siRNA)在體內(nèi)外研究中實(shí)驗(yàn)結(jié)果相悖的機(jī)制，迸一步探討短效Caspase-3 siRNA對(duì)凋亡通路蛋白caspase-3活化的影響，闡明短效Caspase-3 siRNA的激活固有免疫反應(yīng)機(jī)制，為其臨床轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:選擇25-30kg雄性廣西巴馬小型豬12只，隨機(jī)分為

2、I/R組6只(I/R)，Caspase-3 siRNA組6只（IR+siRNA）。建立小型豬原位自體腎移植模型，根據(jù)前期研究，左腎切取后siRNA組應(yīng)用預(yù)配40ml UW器官保存液+0.3mg短效Caspase-3 siRNA（合成序列5'-GGGAGACCUUCACAAACUUtt-3'與5'-AAGUUUGUGAAGGUCUCCCtg-3'）加壓灌注，I/R組應(yīng)用UW器官保存液同樣加壓灌注，冷藏24小時(shí)，移植前留取冷藏后腎臟穿刺標(biāo)本

3、，再移植到右腎原位。各組于缺血再灌注后48h切取腎臟組織標(biāo)本。應(yīng)用real time PCR檢測(cè)各組腎臟組織中Caspase-3 mRNA及Toll樣受體信號(hào)通路下游相關(guān)炎性因子的mRNA相對(duì)載量，應(yīng)用western blot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組小型豬腎組織中前體Caspase-3、活化型Caspase-3的表達(dá)水平。應(yīng)用western blot方法檢測(cè)各組腎組織中TLR-3、TLR-7、 TRIF、MyD88、PKR、RIG-1、HMGB1蛋

4、白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:自體腎移植48小時(shí)后，IR+siRNA組腎臟組織內(nèi)TLR-3、TLR-7、MyD88、TRIF、PKR蛋白含量均較IR組有顯著上升，半定量結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;IR+siRNA組腎臟組織中，Toll樣受體信號(hào)通路下游相關(guān)炎性細(xì)胞因子mRNA水平較IR組有明顯升高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;免疫印跡法檢測(cè)Caspase-3蛋白載量，半定量結(jié)果顯示:移植前穿刺標(biāo)本，siRNA組較I/R組Caspase-3蛋白載量明顯

5、減少（吸光度OD值1.02±0.24 vs.2.32±0.28，p＜0.01），但移植后48h腎臟標(biāo)本，siRNA組較I/R組Caspase-3的17kD活性裂解片段明顯增多（OD值:0.22±0.04 vs.0.06±0.01，p＜0.05）。移植后48小時(shí)，IR+siRNA組腎臟組織標(biāo)本中HMGB1的蛋白載量顯著高于IR組，半定量結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:本研究中應(yīng)用的人工合成的siRNA能有效沉默局部Caspase-3

6、 mRNA轉(zhuǎn)錄Caspase-3蛋白，在冷保存過程中有效減少細(xì)胞凋亡，但移植后腎臟的損傷反而有所增加，凋亡細(xì)胞增多，活性Caspase-3裂解片段水平上升;造成這一結(jié)果的主要原因是由Toll樣受體系統(tǒng)識(shí)別外源性siRNA，觸發(fā)啟動(dòng)了機(jī)體的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)了局部組織的炎性損傷與細(xì)胞凋亡;這一損傷作用能夠持續(xù)至48小時(shí)，可能的機(jī)制為負(fù)反饋循環(huán)作用以及HMGB1蛋白參與了后續(xù)的循環(huán)級(jí)聯(lián)放大炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡過程;siRNA療法作為新型干預(yù)