食物中晚期糖基化終產(chǎn)物對5-6腎切除大鼠的腎臟損害作用及其機制.pdf

1、研究背景 晚期糖基化終產(chǎn)物(advancedglycationendproducts，AGEs)是糖的醛基組和蛋白質(zhì)的氨基酸組之間非酶性糖基化反應(yīng)(Maillard反應(yīng))的終產(chǎn)物。是多種不同分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)的混合物。目前已明確結(jié)構(gòu)的一些AGEs組分是：戊糖苷、羧甲基賴氨酸(CML)、咪唑鎓鹽類(GOLD，MOLD)、咪唑啉酮和吡咯啉等。 正常人體內(nèi)該反應(yīng)進行的非常緩慢，通常只發(fā)生于某些轉(zhuǎn)換率很低的蛋白質(zhì)，故各種膠原結(jié)構(gòu)中的A

2、GEs水平隨年齡增長而緩慢增加。但在慢性腎功能衰竭時，血漿AGEs的水平比糖尿病患者及腎功能正常者升高約7倍，組織中AGEs的潴留與血漿AGEs的水平升高相一致。造成慢性腎功能衰竭時AGEs蓄積的原因尚不清楚，目前認為除經(jīng)典的糖基化通路合成增加或者經(jīng)腎臟排泄AGEs下降外，氧化和羰基應(yīng)激也具有重要作用。 近年研究發(fā)現(xiàn)人類日常飲食中含有大量AGEs，因為食物在加熱過程中會產(chǎn)生大量AGEs。研究表明食物中的AGEs約有10％～30％

3、經(jīng)消化道吸收進入體內(nèi)，其中主要是低分子量的AGEs，其吸收的量遠遠超過在高血糖狀態(tài)下內(nèi)源性生成的AGEs的量。經(jīng)消化道吸收的AGEs量與循環(huán)AGEs水平直接相關(guān)。 目前認為AGEs是一類重要的尿毒癥毒素，已經(jīng)證實AGEs參與透析相關(guān)性淀粉樣變、加速性動脈粥樣硬化等尿毒癥并發(fā)癥的發(fā)病機制。我們假設(shè)食物中AGEs通過加速體內(nèi)AGEs蓄積，促進腎臟纖維化加速慢性腎臟病的進展。本課題以5/6腎切除大鼠作為慢性腎臟疾病的動物模型，通過喂飼

4、不同AGEs含量飼料，觀察食物中的AGEs對慢性腎臟疾病腎臟纖維化的影響，并且對其作用機制進行進一步的探討。 材料和方法 一：含不同水平AGEs大鼠飼料的制作及飼料中AGEs含量的測定 普通大鼠飼料由廣東省實驗動物中心提供。高AGEs大鼠飼料：新鮮烤制的面包，取面包皮在烤箱180℃烘烤2小時，90℃放置22小時后，與普通大鼠飼料按1∶1混合壓制成顆粒飼料；低AGEs大鼠飼料：新鮮烤制的面包，取面包芯室溫自然風(fēng)干，

5、按1∶1比例與普通大鼠飼料混合后壓制成顆粒飼料。使用熒光分光光度法和競爭性ELISA法測定三種大鼠飼料中AGEs熒光強度和CML的含量。高AGEs飼料比普通飼料AGEs熒光強度增加約1.25倍，CML含量增加約2.62倍；比低AGEs飼料AGEs熒光強度增加約1.76倍，CML含量增加約4.95倍。 二.實驗動物分組及標(biāo)本收集 雄性Sprague-Dawley大鼠120只(南方醫(yī)院實驗動物中心提供)，體重220～240g

6、，行5/6腎切除術(shù)(分兩步經(jīng)背部切口切除全部右腎和左腎的2/3)或行假手術(shù)(經(jīng)背部切口暴露腎臟，牽拉腎臟撕裂腎包膜后放回原位)，手術(shù)后一周5/6腎切除大鼠根據(jù)切除左腎比例(切除左腎腎組織重量/右腎重量×100％)隨機分為三組：(1)高AGEs飼料組(2)低AGEs飼料組；(3)普通飼料組。假手術(shù)大鼠。處死前一天禁食，自由飲水，放代謝籠收集24小時尿液。以0.3％戊巴比妥鈉注射液(3.5mg/100g體重)腹腔注射麻醉，腹主動脈取血。50

7、ml冰生理鹽水灌注后摘取左腎。 三.血清及腎組織勻漿中CML含量的測定 采用競爭ELISA法測定血清及腎組織勻漿中CML含量。 四.腎功能測定 使用試劑盒測定血清肌酐和尿肌酐水平，根據(jù)文獻方法計算內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)，并用體重校正；考馬斯亮蘭法測定24小時尿蛋白定量。 五.腎組織病理學(xué)觀察 腎組織經(jīng)4％中性福爾馬林緩沖液固定后，石蠟包埋，2μm切片，經(jīng)PAS、Masson染色，雙盲法觀

8、察組織病理學(xué)改變。采用Reijis半定量法評價腎小球硬化程度和腎小管間質(zhì)纖維化程度。 六.免疫組織化學(xué)染色 腎組織4μm石蠟切片依據(jù)文獻方法行免疫組化染色。使用下列第一抗體：抗ED-1單克隆抗體；多克隆兔抗鼠TGF-β1抗體；多克隆兔抗鼠MCP-1抗體；多克隆兔抗鼠Ⅰ型和Ⅳ型膠原抗體。 七.氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥因子的檢測 用分光光度法測定血清和腎組織勻漿中晚期氧化蛋白終產(chǎn)物(AOPPs)含量。硫代巴比妥酸反

9、應(yīng)法(TBARS)測定24小時尿和腎組織勻漿中TBARS物質(zhì)含量。依據(jù)Flohe等的方法測定血清及腎組織勻漿中硒谷胱甘肽過氧化物酶(SeGSHPx)活性。血清及尿中MCP-1和TGF-β1含量分別采用相應(yīng)的商品化的ELISA試劑盒檢測。 八.RT-PCR檢測腎組織MCP-1、TGF-β1mRNA表達 九.統(tǒng)計分析 手術(shù)各組之間以及手術(shù)對照組和假手術(shù)組之間采用析因分析以及LSD法比較，同一觀察時間點手術(shù)各組之間采用

10、單因素方差分析LSD法比較，同一觀察時間點手術(shù)對照組和假手術(shù)組之間采用獨立樣本的t檢驗。血清和腎組織勻漿CML含量與24小時尿蛋白定量、肌酐清除率、腎組織病理改變和免疫組織化學(xué)半定量積分、氧化應(yīng)激和炎癥因子指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系采用雙變量相關(guān)分析。 結(jié)果 一.5/6腎切除大鼠腎功能及體內(nèi)AGEs水平的變化 喂飼普通飼料的5/6腎切除大鼠24小時尿蛋白含量，血清肌酐水平隨時間延長進行性升高，在各個時間點均顯著高于假手術(shù)組，

11、同時肌酐清除率顯著下降。 喂飼普通飼料的5/6腎切除大鼠血清和腎組織勻漿CML含量隨時間進行性升高。 二.飲食攝入AGEs對循環(huán)和腎組織中AGEs水平的影響 喂飼含高AGEs飼料顯著增加5/6腎切除大鼠循環(huán)中AGEs的含量，在第13周喂飼高AGEs飼料大鼠與普通飼料組相比，血清CML的含量增加約0.6倍，相反，在第13周喂飼含低AGEs飼料大鼠血清CML含量比普通飼料組降低。 三.飲食攝入AGEs對5/6

12、腎切除大鼠腎功能的影響 喂飼含高AGEs的飼料顯著增加5/6腎切除大鼠尿蛋白排泄量，且隨時間進行性加重(處理方式和觀察時間之間交互效應(yīng)顯著F=17.125，p＜0.001)，與喂飼普通飼料的5/6腎切除大鼠相比，高AGEs飼料組大鼠尿蛋白含量在三個時間點均顯著升高(p＜0.05)。 四.飲食攝入AGEs對慢性腎功能不全大鼠殘腎代償性增生的影響。 喂飼含高AGEs飼料顯著增加5/6腎切除大鼠左腎與體重的比例，高AG

13、Es飼料組大鼠左腎與體重的比例在三個時間點均顯著高于普通飼料組(p值均＜0.05)，而低AGEs飼料組大鼠左腎與體重的比例顯著低于普通飼料組，第13周差異有顯著性(p＜0.05)。 五.飲食攝入AGEs對慢性腎功能不全大鼠腎臟纖維化的影響 喂飼含高AGEs飼料顯著增高5/6腎切除大鼠腎小球硬化程度，在第13周高AGEs飼料組大鼠腎小球硬化指數(shù)顯著高于普通飼料組(p=0.013)，相反，與普通飼料相比，低AGEs飼料組大鼠

14、腎小球硬化指數(shù)明顯降低(p=0.03)。 免疫組化染色顯示，5/6腎切除大鼠殘腎腎組織MCP-1表達隨時間延長顯著增強(手術(shù)方式和觀察時間之間交互效應(yīng)顯著F=4.757，p=0.013)，喂飼含高AGEs飼料顯著上調(diào)5/6腎切除大鼠殘腎腎組織MCP-1表達(處理方式和觀察時間之間交互效應(yīng)顯著F=4.785，p=0.002)。 RT-PCR結(jié)果顯示：喂飼含高AGEs飼料顯著上調(diào)第13周5/6腎切除大鼠MCP-1mRNA的表

15、達(F=11.198，p=0.001)，高AGEs飼料組大鼠腎組織MCP-1mRNAPCR產(chǎn)物吸光度比值顯著高于普通飼料組(p=0.03)，而低AGEs飼料組大鼠腎組織MCP-1mRNAPCR產(chǎn)物吸光度比值顯著低于普通飼料組(p=0.04)。 免疫組化染色顯示，5/6腎切除大鼠殘腎腎組織TGF-β1表達隨時間延長顯著增強(手術(shù)方式和觀察時間之間交互效應(yīng)顯著F=4.757，p=0.013)，喂飼含高AGEs飼料顯著促進5/6腎切除

16、大鼠殘腎腎組織TGF-β1表達(處理方式和觀察時間之間交互效應(yīng)顯著F=3.906，p=0.006)，在第13周高AGEs飼料組大鼠腎小球及腎間質(zhì)TGF-β1表達半定量積分值顯著高于普通飼料組(p值均＜0.05)；相反，喂飼含低AGEs飼料減輕5/6腎切除大鼠殘腎腎組織TGF-β1的表達，其半定量積分在第13周均顯著低于普通飼料組(p值均＜0.05)。 RT-PCR結(jié)果顯示：高AGEs飼料顯著上調(diào)第13周5/6腎切除大鼠腎組織TG

17、F-β1mRNA的表達(F=9.237，p=0.002)，高AGEs飼料組大鼠TGF-β1mRNAPCR產(chǎn)物吸光度比值顯著高于普通飼料組(p=0.04)，而低AGEs飼料組大鼠 結(jié)論 食物中的AGEs促進5/6腎切除大鼠循環(huán)和腎組織AGEs潴留，增加尿蛋白排泄量，降低內(nèi)生肌酐清除率，促進腎小球肥大，殘腎組織腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。其機制可能與促進殘腎組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激有關(guān)。因此，限制飲食中AGEs的含量應(yīng)作為延緩慢