經鼻靶向中樞導入rhG-CSF對腦梗死大鼠的治療作用及機理.pdf

1、研究目的： 1.探討經鼻靶向中樞導入重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)對腦梗死大鼠行為和神經功能障礙的改善作用。 2.經鼻靶向中樞導入人重組粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)對腦梗死大鼠FasL和HO-1表達的影響。 3.研究rhG-CSF經鼻靶向中樞給藥對腦梗死大鼠內源性神經干細胞的增殖、分化及其可塑性的影響。 4.觀察經鼻導入rhG-CSF對腦梗死大鼠缺血半暗帶皮層神經元細胞內游離鈣離子濃度

2、([Ca2+]i)及骨架蛋白α-tubulin的影響。 研究方法： 1.線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞模型，缺血2h再灌注。將動物分為正常組、假手術對照組、腦梗死組、腦梗死+皮下注射rhG-CSF組、腦梗死+經鼻生理鹽水組、腦梗死+經鼻rhG-CSF組。于術前及缺血再灌注后1d、3d、7d、14d觀察動物行為學變化，并進行神經功能評分。 2.采用線栓法制作大鼠可逆性大腦中動脈阻塞模型(MCAO，2h后再灌注)。將6

3、0只動物隨機分為正常組(n=6)、假手術對照組(n=6)、腦梗死組(n=12)、腦梗死+皮下注射rhG-CSF組(n=12)、腦梗死+經鼻生理鹽水組(n=12)、腦梗死+經鼻rhG-CSF組(n=12)。于誘導MCAO后1d、3d固定取材，制備腦組織冠狀冰凍切片，用免疫熒光化學技術檢測凋亡蛋白配體(FasL)與血紅素氧合酶-1(HO-1)在腦內的表達，激光共聚焦顯微鏡進行圖像采集，計數陽性細胞數。 3.運用BrdU標記法檢測腦局

4、灶梗死大鼠缺血半暗帶皮層、側腦室下區(qū)(SVZ)與海馬齒狀回顆粒細胞層下區(qū)(SGZ)內源性神經干細胞的增殖情況，運用熒光雙標法檢測BrdU+/GFAP+、BrdU+/NeuN+、BrdU+/PSA-NCAM+在腦內的表達，激光共聚焦顯微鏡進行圖像采集，計數陽性細胞數，確定其分化方向及可塑性。 4.采用線栓法制作MCAO模型(2h后再灌注)。將36只動物隨機分為正常組、假手術對照組、腦梗死組、腦梗死+皮下注射rhG-CSF組、腦梗死+經鼻生

5、理鹽水組、腦梗死+經鼻rhG-CSF組，n=6。于誘導MCAO后1d處死，取梗死側額頂葉背外側皮層制備腦單細胞懸液，免疫組織化學方法借助激光共聚焦與流式細胞儀檢測缺血半暗帶皮層神經元細胞內[ca2+]i、α-tubulin的熒光密度。 研究結果： 1.除正常組、假手術對照組外，其余各組動物于術后出現異常行為改變和神經功能障礙，尤以腦梗死組、經鼻NS組最為明顯，二者之間的差異無統(tǒng)計學意義；皮下rhG-CSF組明顯改善，經鼻

6、rhG-CSF組較皮下組改善更加顯著，差異具有統(tǒng)計學意義。 2.正常組、假手術組腦組織中FasL蛋白和HO-1陽性神經細胞見極少量表達；腦梗死組大鼠FasL蛋白和HO-1的陽性細胞數明顯增加，1d組>3d組。表達區(qū)域主要為灶周皮質(paramedian cortex)和同側海馬：腦梗死組及腦梗死+經鼻生理鹽水組FasL和HO-1的陽性細胞計數差異無統(tǒng)計學意義。rhG-CSF治療后FasL，蛋白表達下降，而HO-1表達上調；在同一

7、時間點，經鼻rhG-CSF組FasL蛋白表達低于皮下注射rhG-CSF組，而HO-1表達前組高于后組。 3.正常組及假手術組大鼠腦內存在少量BrdU陽性細胞。經鼻給予rhG-CSF組大鼠腦內BrdU陽性細胞數明顯增加，鼻腔給予rhG-CSF組>皮下給予rhG-CSF組>腦梗死組。在SVZ和SGZ區(qū)域，7d組高于14d組；在缺血半暗帶皮層，14d組高于7d組。除脈絡叢外，經鼻給予rhG-CSF組大鼠腦內各部位均有BrdU+/GFA

8、P+表達。各表達區(qū)域的BrdU+/GFAP+細胞數于再灌注后7d表達明顯增高，鼻腔給予rhG-CSF組>皮下給予rhG-CSF組>腦梗死組，14d略有下降，降幅：鼻腔給予rhG-CSF組>皮下給予rhG-CSF組>腦梗死組。經鼻給予rhG-CSF后腦梗死大鼠腦內BrdU+/NeuN+和BrdU+/PSA-NCAM+細胞數也明顯增加。在各時間段及各表達部位，不同分組之間BrdU+/NeuN+和BrdU+/PSA-NCAM+的表達順序：鼻腔

9、給予rhG-CSF組>皮下給予rhG-CSF組>腦梗死組。 4.假手術對照組與正常組比較，細胞內[Ca2+]i、α-tubulin無變化；腦梗死后神經元細胞內[Ca2+]i明顯升高，升高幅度：腦梗死組>皮下注射rhG-CSF組>經鼻rhG-CSF組：α-tubulin表達降低，降低幅度經鼻生理鹽水組>皮下注射rhG-CSF組>經鼻rhG-CSF組。 研究結論： 1.重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)能改善

10、局灶性腦缺血大鼠的神經功能障礙，鼻腔給藥比皮下給藥療效更顯著。 2.經鼻應用rhG-CSF可以使凋亡蛋白配體FasL表達下降，HO-1表達上調，從而發(fā)揮對缺血性腦組織的保護作用。 3.rhG-CSF經鼻靶向中樞給藥可以促進腦梗死后大鼠內源性神經干細胞的增殖和分化，增強其可塑性。 4.經鼻導入rhG-CSF可以比皮下給藥更明顯地抑制腦梗死大鼠缺血半暗帶神經元胞內[ca2+]i的升高，減少α-微管蛋白(α-tubul