GLP-1重組畢赤酵母的構(gòu)建和rGLP-1的表達(dá)、純化及鑒定.pdf

1、目的:構(gòu)建GLP-1重組畢赤酵母,篩選出高表達(dá)rGLP-1的重組畢赤酵母株,優(yōu)化rGLP-1表達(dá)條件和建立純化工藝,鑒定純化后的rGLP-1純度和生物活性.方法:通過PCR方法獲得的GLP-1基因片段,經(jīng)Not Ⅰ酶切后,插入到質(zhì)粒pPIC9K中.重組的GLP-1-pPIC9K質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115后,通過His-和G418平板篩選高表達(dá)菌株.設(shè)定四個(gè)不同的甲醇濃度,研究其對rGLP-1表達(dá)量的影響,同時(shí)研究了誘導(dǎo)時(shí)間的變化對rGL

2、P-1表達(dá)量的影響.應(yīng)用反相層析、陰離子交換層析和凝膠過濾層析對rGLP-1進(jìn)行純化.并用SDS-PAGE和HPLC對純化后的rGLP-1純度進(jìn)行鑒定.使用RINm5F細(xì)胞檢測純化后的rGLP-1體外促進(jìn)胰島素分泌的活性.建立2型糖尿病大鼠模型,并在此模型中對rGLP-1的體內(nèi)降血糖作用進(jìn)行研究.結(jié)果:1、成功構(gòu)建了重組GLP-1畢赤酵母.2、篩選出高表達(dá)rGLP-1的重組GLP-1畢赤酵母株.3、證實(shí)在1%的甲醇濃度和誘導(dǎo)三天時(shí),rG

3、LP-1表達(dá)量最高.4、優(yōu)化出的純化工藝:離心→反相層析→陰離子交換層析→凝膠過濾→凍干.5、純度鑒定認(rèn)為rGLP-1 SDS-PAGE未見其他雜帶,HPLC證實(shí)純化的rGLP-1純度達(dá)到97%.6、純化后的rGLP-1在體外可以明顯促進(jìn)RINm5F細(xì)胞分泌胰島素,7、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)rGLP-1可以降低糖尿病大鼠血糖至正常水平.結(jié)論:獲得了高表達(dá)rGLP-1的重組GLP-1畢赤酵母株,優(yōu)化了rGLP-1的表達(dá)條件.建立了純化工藝,rGLP