低劑量砷染毒動(dòng)物肝臟損傷及差異蛋白研究.pdf

1、目的：⑴動(dòng)態(tài)觀察低劑量亞慢性砷染毒家兔在染毒不同時(shí)間的肝臟損傷情況。⑵建立不同劑量砷染毒SD大鼠的動(dòng)物研究模型，研究亞砷酸鈉染毒SD大鼠和正常SD大鼠肝臟蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜及表達(dá)的差異蛋白點(diǎn)，進(jìn)一步闡明低劑量染砷對(duì)肝臟損傷的機(jī)制，尋找低劑量砷中毒的生物標(biāo)志物，為早期砷中毒防治提供一些科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：①成年家兔12只，隨機(jī)分為四組，即對(duì)照組(0μg/L)，低劑量染毒組(10μg/L)，中劑量染毒組(50μg/L)，高劑量

2、染毒組(250μg/L)。染毒8周，12周后用SYSMEX-180型全自動(dòng)生化儀分別測(cè)定各組家兔血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、r-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(r-GT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLP)等含量。染毒12周末處死家兔，測(cè)定肝臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)、肝臟超氧化物歧化酶(SOD)，且染色觀察肝臟的病理組織變化。原子熒光吸收光譜法測(cè)定肝臟和膽汁的總砷含量。

3、②成年SD大鼠48只，隨機(jī)分為四組，每組12只，即對(duì)照組(0μg/L)，低劑量染毒組(50μg/L)，中劑量染毒組(150μg/L)，高劑量染毒組(450μg/L)。染毒4周后處死大鼠，觀察指標(biāo)為：體重、主要臟體比。原子熒光吸收光譜法測(cè)定血砷和肝臟砷。運(yùn)用雙向凝膠電泳尋找鑒定染毒SD大鼠和正常SD大鼠肝臟蛋白質(zhì)組差異表達(dá)。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：⑴家兔體重變化：染毒組體重和對(duì)照組體重隨觀察時(shí)間的延長(zhǎng)而

4、增加，但是10μg/L劑量體重增長(zhǎng)較其他劑量組更為明顯。⑵家兔肝臟相關(guān)血清酶學(xué)指標(biāo)變化：250μg/L組染毒8W，AST與同期對(duì)照組相比升高(P＜0.05)，12W時(shí)，AST和ALP均升高(P＜0.05)。；50μg/L組染毒12W，ALT、ALP、γ-GT與同期對(duì)照組相比升高(P＜0.05)；10μg/L組AST、ALT、ALP、γ-GT在整個(gè)染毒過程中均未出現(xiàn)明顯改變。⑶家兔肝臟相關(guān)血清蛋白質(zhì)變化：隨著染毒劑量和時(shí)間的增加各劑量組的

5、總蛋白、白蛋白、球蛋白、白球比與同期對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。⑷家兔肝臟脂質(zhì)過氧化指標(biāo)變化：隨著染毒劑量的升高M(jìn)DA水平升高，SOD活性降低且150μg/L、450gg/L劑量組MDA水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)；150μg/L、450μg/L劑量組SOD活性顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。⑸家兔肝臟鏡下觀察：光鏡下，對(duì)照組肝小葉的結(jié)構(gòu)完整，無肝細(xì)胞的壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。10μg/L劑量組少見中央靜脈充血，50

6、μg/L劑量組除有靜脈擴(kuò)張充血外，多見肝細(xì)胞的邊界不清，排列紊亂。250μg/L劑量組中央靜脈周肝細(xì)胞消失，代之明顯增生的纖維細(xì)胞及多量的膠原。殘存的肝細(xì)胞排列略有紊亂，偶見肝竇略有擴(kuò)張。⑹家兔體內(nèi)砷含量變化：隨著染毒劑量的升高肝臟砷和膽汁砷也增高，且與對(duì)照組相比250μg/L劑量組膽汁砷含量增加(P＜0.05)。⑺大鼠主要臟體比：與對(duì)照組相比，50μg/L劑量組的肝體比、心體比和腎體比均增加(P＜0.05)；肝臟體比150μg/L劑量

7、組與對(duì)照組相比也增加(P＜0.05)；各染毒組肺體比、脾體比、腦體比與對(duì)照組相比無明顯變化。⑻大鼠肝臟組織中蛋白雙向凝膠電泳的結(jié)果：與對(duì)照組相比，50μg/L劑量組不表達(dá)的點(diǎn)有31個(gè)，表達(dá)下調(diào)的點(diǎn)有11個(gè)，表達(dá)上調(diào)的點(diǎn)1個(gè)；與對(duì)照組相比，150μg/L劑量組不表達(dá)的點(diǎn)有23個(gè)，表達(dá)下調(diào)的點(diǎn)有15個(gè)，沒有出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的點(diǎn)；與對(duì)照組相比，450μg/L劑量組沒有出現(xiàn)不表達(dá)的點(diǎn)，表達(dá)下調(diào)的點(diǎn)有8個(gè)；表達(dá)上調(diào)的點(diǎn)1個(gè)。
　　 結(jié)論：①本

8、研究中，肝臟相關(guān)血清酶含量、分泌型蛋白合成以及病理組織檢測(cè)結(jié)果顯示，10μg/L劑量染毒對(duì)家兔的肝臟沒有產(chǎn)生明顯的毒性，而10μg/L這個(gè)劑量家兔的體重增長(zhǎng)比較明顯。②50μg/L和250μg/L劑量組家兔肝臟相關(guān)血清酶升高，其中AST的變化出現(xiàn)在染毒的8W，較其他相關(guān)血清酶學(xué)變化出現(xiàn)的早，說明在肝臟相關(guān)血清酶學(xué)中，AST是較為早期的反映砷染毒肝臟損傷的敏感指標(biāo)。肝臟中央靜脈充血及不同程度的肝細(xì)胞排列紊亂，尤其是250μg/L可見膠原和

9、纖維細(xì)胞增生。本實(shí)驗(yàn)的染毒劑量下，沒發(fā)現(xiàn)對(duì)肝臟蛋白質(zhì)合成造成影響。③肝臟的脂質(zhì)過氧化，50μg/L及以上劑量組肝臟出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)，且隨著染毒劑量的增加而逐漸加重。同時(shí)也提示，50μg/L及以上劑量組肝臟輕度的組織病理學(xué)的改變和血清酶含量的變化可能和肝臟的脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)。④家兔和大鼠體內(nèi)砷含量檢測(cè)顯示，砷在肝臟和血液中蓄積，且肝臟砷通過肝臟代謝后，經(jīng)由膽汁排泄。⑤50μg/L劑量大鼠的肝體比、心體比和腎體比均升高，說明5

10、0μg/L劑量砷染毒除肝臟外，對(duì)心臟和腎臟也有一定的毒性作用。⑥差異蛋白本研究獲得了分辨率較高、重復(fù)性較好的砷染毒大鼠肝臟雙向凝膠電泳圖譜，結(jié)果顯示各劑量組肝臟蛋白表達(dá)量有不同程度的差異，染毒組肝臟差異蛋白主要表現(xiàn)為表達(dá)下調(diào)或不表達(dá)：染毒50μg/L劑量和150μg/L劑量不表達(dá)和表達(dá)下調(diào)的蛋白點(diǎn)較多，其中重復(fù)不表達(dá)的和重復(fù)表達(dá)下調(diào)的蛋白點(diǎn)居多數(shù)，且多數(shù)居于膠條的堿性端，分別是點(diǎn)4301、4303、4904、4905、5505、6003