AS病人LDL-R、ER-α基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)的改變及其與AS發(fā)病的關(guān)系.pdf

1、目的：動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的形成是多因素參與的復(fù)雜過程，迄今仍有許多細(xì)節(jié)機制有待闡明。近年來，基因表達的表遺傳(epigenetic)調(diào)控異常被發(fā)現(xiàn)在AS發(fā)病機制中占有重要的一席。資料顯示在AS的發(fā)生、發(fā)展過程中出現(xiàn)整體基因組低甲基化，而某些特定基因啟動子區(qū)CpG島甲基化程度增加。 低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDL-R)異常在AS發(fā)生中占有

2、舉足輕重的地位，有關(guān)LDL-R基因突變的研究報導(dǎo)很多，并顯示其與家族性高膽固醇血癥、AS之間明確的因果關(guān)系。但有關(guān)LDL-R基因啟動子區(qū)的甲基化修飾在AS病人是否出現(xiàn)異常、及其與AS的關(guān)系研究卻迄今未見報導(dǎo)。 對AS病人的表遺傳研究顯示，AS患者粥樣斑塊中雌激素受體α(estrogen receptor-α，ER-α)基因的甲基化水平顯著增高，及ER-α的表達下調(diào)。Kortelaine用ER的單克隆抗體檢測發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)前的女性AS

3、患者的ER-α表達降低，提示ER-α基因表達沉默與AS形成間的相關(guān)性。但何種致病因素導(dǎo)致AS病人ER-α基因高甲基化亦未見報導(dǎo)。 高同型半胱氨酸(high homocysteine，Hhcy)血癥已被確立為AS的獨立危險因子，有關(guān)同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)致病機制的研究報導(dǎo)很多，但多集中于其引起的氧化應(yīng)激損傷。上世紀(jì)九十年代后期，P.ENewman提出Hcy導(dǎo)致異常甲基化推動AS形成，理由是過多的Hcy影響

4、DNA甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)的合成。從而將AS、Hcy和甲基化三者之間的關(guān)系聯(lián)系在一起。 因此，本研究擬選定與AS關(guān)系最緊密的LDL-R、ER-α，探討AS病人LDL-R、ER-α基因啟動子區(qū)CpG島甲基化的改變及其與Hhcy的內(nèi)在關(guān)系。以期為深入研究AS的發(fā)病機制提供一個全新的視角。 本研究分兩部分對上述問題進行研究，即：AS病人外周血細(xì)胞基因組LDL-R基因啟動

5、子區(qū)的甲基化異常；AS病人ER-α基因啟動子區(qū)甲基化、高同型半胱氨酸血癥與AS的發(fā)病。 方法：入選61例AS病人和28例健康對照者，行頸部血管彩超檢查證實AS病人頸部血管均有AS斑塊形成而健康對照者無。所有研究對象均采集肘靜脈血提取基因組DNA，改進并聯(lián)合應(yīng)用巢式、Touchdown-PCR，甲基化敏感單鏈構(gòu)象分析法(methylation-sensitive-single-strand conformation analysi

6、s，MS-SSCA)，對61例AS病人及28例健康對照者的LDL-R基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)進行檢測。 82例研究對象分為AS組(54例)和對照組．(28例)，所有入選對象均行頸部血管彩超檢查，記錄頸動脈內(nèi)膜中層厚度(carotid intima-mediathickness，CIMT)及有無斑塊形成，采用Crouse氏方法計算頸動脈斑塊積分。采集清晨空腹肘靜脈血3ml，其中2ml用來提取基因組DNA，1ml血用來檢測血

7、總同型半胱氨酸(total homocysteine，tHcy)水平，巢式甲基化特異性PCR(nested-methylation-specific PCR，nMSP)法檢測研究對象ER-α啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)，熒光生化法檢測血tHcy水平，spearman等級相關(guān)分析甲基化程度與tHcy的相關(guān)關(guān)系。 結(jié)果：在61例AS患者中，LDL-R基因啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)三種不同的甲基化模式，即完全甲基化、部分甲基化和非甲基化。61例AS

8、患者中有2例LDL-R基因啟動子區(qū)完全甲基化，13例部分甲基化，其余為非甲基化，甲基化率為24.59％；28例正常對照者中僅1例發(fā)生部分甲基化，甲基化率為3.57％。兩組甲基化率差異有顯著性(p<0.05)． 54例AS患者中有38例ER-α基因啟動子區(qū)CpG島甲基化，甲基化率為70.4％；28例健康對照者中有8例ERα基因啟動子區(qū)CpG島甲基化，甲基化率為28.6％；兩組甲基化率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時，AS組t

9、Hcy水平顯著高于對照組(P<0.05)，經(jīng)spearman等級相關(guān)分析，ER-α基因啟動子區(qū)甲基化程度與血tHcy水平相關(guān)系數(shù)為r=0.809；且隨血tHcy水平升高，AS病損程度亦遞次加重。 結(jié)論：AS病人LDL-R基因啟動子區(qū)甲基化程度增高，在LDL-R基因調(diào)控區(qū)的高甲基化修飾可能參與了AS的發(fā)病。同時，改進并聯(lián)合應(yīng)用的巢式PCR、Touchdown-PCR，MS-SSCA法降低了對DNA模板嚴(yán)格度的要求，提高了靈敏度和特