TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的抑制作用及機(jī)制研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是以慢性、進(jìn)展性和侵蝕性關(guān)節(jié)炎為特點(diǎn)的一類自身免疫性疾病，最終表現(xiàn)為骨質(zhì)的破壞、關(guān)節(jié)的畸形，致殘率極高。目前RA的治療以免疫抑制劑為主，但治療的副作用較大。
　　 已知CD4+CD25+Foxp3+的天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Natural Ocurring Regulatory TCells，nTregs)數(shù)量的減少和/或功能的降低與RA的發(fā)病有關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在RA小鼠

2、模型輸注nTregs可以預(yù)防關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和減輕關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。但是，在已發(fā)病的RA經(jīng)典小鼠模型--膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)中，即使額外輸注nTregs，對(duì)關(guān)節(jié)炎也沒有起到改善作用。近來，本研究小組發(fā)現(xiàn)，TGF-β誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Induced Regulatory T cells，iTregs)不僅具有與nTregs相同的表型和抑制關(guān)節(jié)炎發(fā)病的功能，而且在體外促炎癥因子白介素

3、-6(Interleukin6，IL-6)的作用下能表現(xiàn)出更強(qiáng)的穩(wěn)定性和對(duì)效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的抑制力。因此，本論文第一部分的研究旨在比較nTregs和iTregs對(duì)CIA預(yù)防與治療作用的差異。
　　 關(guān)節(jié)破壞是RA患者最常見的癥狀和轉(zhuǎn)歸，破骨細(xì)胞在RA患者的骨質(zhì)重建中發(fā)揮重要作用；破骨細(xì)胞是一種多核巨細(xì)胞，主要功能是骨質(zhì)吸收，生理?xiàng)l件下與成骨細(xì)胞一起維持骨代謝的平衡；而破骨細(xì)胞的過度激活和功能異常被認(rèn)為是炎性關(guān)節(jié)病人骨質(zhì)侵蝕的重要

4、誘因；已有報(bào)道在RA的CIA小鼠模型中觀察到破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(Osteoclast precursors，OCPs)的數(shù)量增多。破骨細(xì)胞起源于骨髓，其前體細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄因子-κB受體激活因子配體(Receptor Activator ofNuclear Factor-κB，RANKL)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MacrophageColony-stimulating Factor，M-CSF)的共同作用下，進(jìn)一步分化為成熟的破骨細(xì)胞；RANK

5、L和M-CSF是破骨細(xì)胞生成過程所必須的兩個(gè)細(xì)胞因子，任何一個(gè)缺失或信號(hào)途徑的阻斷都會(huì)影響破骨細(xì)胞的分化。因此，破骨細(xì)胞的生成已成為關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)破壞及治療的重要靶點(diǎn)。已有報(bào)道證實(shí)，激活的nTregs可以抑制破骨細(xì)胞的生成，而iTregs具有與nTregs相似的表型和抑制功能。因此，本論文第二部分研究是在第一部分研究的基礎(chǔ)上，探討iTregs是否可以通過抑制破骨細(xì)胞的生成而發(fā)揮其對(duì)CIA模型動(dòng)物的骨質(zhì)侵蝕及破壞的抑制能力。
　　 實(shí)

6、驗(yàn)結(jié)果：
　　 第一部分：TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞制備、鑒定及對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的抑制、治療作用1.TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的制備、鑒定自DBA1/J小鼠的脾臟分離出幼稚的CD4+細(xì)胞。以牛CⅡ型膠原(bovinecollagenⅡ，CⅡ)多肽、白介素-2(Interleukin-2，IL-2)和TGF-β誘導(dǎo)Tregs(iTregs)，單用IL-2培養(yǎng)的細(xì)胞為

7、效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，作為Tregs的對(duì)照(Tcon)。nTregs分離自同種小鼠的胸腺，在培養(yǎng)液中加入IL-2進(jìn)行體外擴(kuò)增，流式細(xì)胞儀、Western Blotting和PCR法分別檢測(cè)Foxp3的表達(dá)；同時(shí)nTregs和iTregs分別與效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)(綠色熒光蛋白CFSE標(biāo)記法和增生實(shí)驗(yàn))，比較兩者對(duì)效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞增生的抑制能力，實(shí)驗(yàn)設(shè)立基線值(baseline)、nTregs組、Tcon組和iTregs組。
　　

8、1.1 TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Foxp3的表達(dá)流式細(xì)胞儀的結(jié)果顯示，經(jīng)過擴(kuò)增的nTregs與誘導(dǎo)的iTregs，F(xiàn)oxp3的表達(dá)相近，多在60％以上，而Tcon Foxp3的表達(dá)僅為10％左右。計(jì)數(shù)培養(yǎng)孔內(nèi)的CD25+Foxp3+細(xì)胞數(shù)，Tcon組的細(xì)胞數(shù)顯著低于iTregs組。Western Blotting檢測(cè)CD4+CD25-細(xì)胞、nTregs、Tcon和iTregs Foxp3蛋白的表達(dá)水平，

9、nTregs與iTregsFoxp3蛋白的表達(dá)相近并均顯著高于CD4+CD25-細(xì)胞和Tcon。PCR法檢測(cè)Foxp3mRNA的水平，nTregs與iTregs Foxp3 mRNA的水平相近并均顯著高于CD4+CD25-細(xì)胞和Tcon。
　　 1.2 TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的抑制能力體外CFSE標(biāo)記法與增生實(shí)驗(yàn)法均證實(shí)，與基線值、Tcon組相比，iTregs擁有與nTreg

10、s相似的對(duì)效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞增生的抑制功能，而Tcon則與基線值相近，無法抑制T淋巴細(xì)胞的增生。
　　 2 TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)CIA的抑制和治療作用采用牛Ⅱ型膠原(4mg/mL)和完全弗式佐劑(體積比1:1)乳化液50ul于小鼠尾根部皮下注射誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠模型，在免疫后的第0天、第14天和第28天分別自小鼠尾靜脈輸注3×106 nTregs或iTregs，小鼠隨機(jī)分為4組：CIA模型組、n

11、Tregs注射組、Tcon組和iTregs組，發(fā)病后隔天觀察小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率及臨床評(píng)分。檢測(cè)血清抗CⅡ特異性抗體的水平以及關(guān)節(jié)組織學(xué)染色，進(jìn)一步評(píng)估疾病的嚴(yán)重程度。
　　 2.1 TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)CIA的預(yù)防作用在DBA1/J小鼠免疫后的第0天分別注射nTregs和iTregs，兩者都可顯著抑制關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展；在免疫后的第14天分別注射nTregs和iTregs，iTregs仍可

12、降低關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，兩者均可顯著降低關(guān)節(jié)炎的臨床評(píng)分；并且檢測(cè)血清抗CⅡ特異性抗體水平發(fā)現(xiàn)，兩種Tregs均可顯著抑制抗CⅡ IgG2b的水平。
　　 2.2 TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)CIA的治療作用在DBA1/J小鼠免疫后的第28天(即關(guān)節(jié)炎發(fā)病后)分別注射nTregs和iTregs，iTregs而非nTregs可以顯著抑制關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和嚴(yán)重程度，以及血清抗CⅡ IgG2a和IgG2b的水平；

13、病變關(guān)節(jié)組織學(xué)染色顯示，iTregs可以顯著抑制關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)及骨質(zhì)破壞的發(fā)生；分離自關(guān)節(jié)炎小鼠體內(nèi)的淋巴細(xì)胞體外增生實(shí)驗(yàn)顯示，iTregs尚可抑制淋巴細(xì)胞的增生程度和促炎癥因子的水平；而nTregs則完全喪失了對(duì)關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用。
　　 小結(jié)：
　　 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，iTregs擁有與nTregs相似的表型和對(duì)T淋巴細(xì)胞增生的抑制能力；同時(shí)，對(duì)CIA具有與nTregs相似的預(yù)防作用；但在已發(fā)病的關(guān)節(jié)炎小鼠，iTr

14、egs而非nTregs具有明確的治療作用且抑制了關(guān)節(jié)破壞的發(fā)生，nTregs則完全喪失了對(duì)關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用。
　　 第二部分：TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞預(yù)防和治療CIA的機(jī)制研究基于第一部分的研究結(jié)果，iTregs較nTregs在已發(fā)病的關(guān)節(jié)炎小鼠具有穩(wěn)定的治療作用，并可抑制骨質(zhì)破壞的發(fā)生，我們?cè)诒静糠謱⑦M(jìn)一步探究其作用機(jī)制。
　　 3 TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性

15、T細(xì)胞在體內(nèi)、外的穩(wěn)定性按照1中的描述分別制備nTregs與iTregs，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：
　　 3.1 TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在體外的穩(wěn)定性采用與1.2相同的CFSE標(biāo)記法與增生實(shí)驗(yàn)鑒定兩者對(duì)效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的抑制作用，同時(shí)設(shè)立IL-6添加組(IL-6+)與非添加組(IL-6-)，檢測(cè)在促炎癥因子IL-6存在的情況下，兩種Tregs抑制力的變化。建立Th17細(xì)胞培養(yǎng)體系即IL-6+TGF-β誘

16、導(dǎo)幼稚的CD4+細(xì)胞向Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在培養(yǎng)液中同樣分別加入nTregs、iTregs(Tregs：幼稚CD4+細(xì)胞=1:4)，比較兩組IL-17A生成的水平。
　　 結(jié)果顯示，在IL-6作用下，nTregs而非iTregs顯著地喪失了其對(duì)效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的抑制作用，并且無法抑制Th17細(xì)胞的分化及IL-17A的生成；而iTregs則始終保持著良好的抑制能力。
　　 3.2 TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3

17、+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在體內(nèi)的穩(wěn)定性來自GFP-Foxp3轉(zhuǎn)基因小鼠的nTregs和iTregs分別注射入免疫缺陷(CD3-/-)的小鼠體內(nèi)，分別在注射后4周和8周觀察Foxp3水平的變化；綠色熒光蛋白CFSE標(biāo)記來自正常DBA1/J小鼠的兩種Tregs并注射到同種小鼠體內(nèi)，分別在注射后的1周和3周，檢測(cè)兩種Tregs Foxp3水平的變化；另將標(biāo)記了CFSE的兩種Tregs分別注射入已發(fā)病的關(guān)節(jié)炎小鼠(炎性小鼠)體內(nèi)，觀察兩種Tregs在炎性

18、環(huán)境下的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)歸。
　　 3.2.1 TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在免疫缺陷和正常小鼠體內(nèi)環(huán)境下的穩(wěn)定性在注射后4周和8周，nTregs和iTregs同樣可以維持Foxp3的表達(dá)，F(xiàn)oxp3表達(dá)占CD3+細(xì)胞的百分比為50％左右。在正常體內(nèi)環(huán)境下，nTregs和iTregs同樣可以維持Foxp3的表達(dá)在50％左右(Foxp3占CFSE+細(xì)胞的百分比)。
　　 3.2.2 TGF-β誘導(dǎo)的

19、CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在關(guān)節(jié)炎小鼠炎性環(huán)境下的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于iTregs，nTregs在細(xì)胞注射后1周的關(guān)節(jié)炎小鼠的引流淋巴結(jié)內(nèi)，更易于凋亡、Foxp3的表達(dá)丟失并向Th2和Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化；相反，iTregs在相似的炎性環(huán)境下能夠維持Foxp3的表達(dá)且不會(huì)向輔助性T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在nTregs注射組的關(guān)節(jié)炎小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞中，Th17細(xì)胞的數(shù)量是iTregs組的10倍，而CFSE+Foxp3+細(xì)胞的數(shù)量為

20、iTregs組的八分之一，提示了iTregs能夠在炎性環(huán)境下誘導(dǎo)出更多的Foxp3+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生。
　　 4 TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過抑制破骨細(xì)胞的生成發(fā)揮對(duì)CIA的保護(hù)作用nTregs可以抑制破骨細(xì)胞的生成，而破骨細(xì)胞的生成過多是造成關(guān)節(jié)炎骨質(zhì)破壞的主要因素；由此，我們將探究iTregs是否也通過抑制破骨細(xì)胞的生成而發(fā)揮對(duì)關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用。
　　 分離自正常DBA1/J小鼠

21、骨髓的CD11c+細(xì)胞即破骨細(xì)胞前前體細(xì)胞(Osteoclast Precursors，OCPs)，以RANKL和M-CSF共同誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的生成；同時(shí)在培養(yǎng)液中分別加入CD4+CD25-細(xì)胞、nTregs、Tcon和iTregs，抗酒石酸磷酸酶(Tartrate-risistant acid phosphatase，TRAP)染色，觀察各種細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞生成的影響。
　　 nTregs、iTregs分別在免疫后14天注射入關(guān)節(jié)

22、炎小鼠體內(nèi)，觀察期(56天)后，病變關(guān)節(jié)行CT掃描，觀察關(guān)節(jié)骨質(zhì)侵蝕、破壞的發(fā)生與不同。
　　 4.1 TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在體外對(duì)破骨細(xì)胞生成的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與基線值(baseline)、CD4+CD25-細(xì)胞組和Tcon組相比，nTregs和iTregs均可顯著抑制破骨細(xì)胞的生成；減少加入的iTregs比例，破骨細(xì)胞的生成有所增加，但與Tcon相比，破骨細(xì)胞的生成仍受到顯著抑制。

23、提示iTregs對(duì)破骨細(xì)胞生成的抑制為劑量相關(guān)性的。
　　 4.2 TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)骨質(zhì)侵蝕和破壞的抑制作用CT掃描結(jié)果顯示，CIA模型組小鼠的關(guān)節(jié)呈慢性多關(guān)節(jié)炎的表現(xiàn)，關(guān)節(jié)表面骨質(zhì)侵蝕明顯，關(guān)節(jié)腔融合，關(guān)節(jié)強(qiáng)直，骨量減少；而iTregs僅表現(xiàn)為一側(cè)關(guān)節(jié)的輕度關(guān)節(jié)腔狹窄，無骨質(zhì)侵蝕的發(fā)生，關(guān)節(jié)腔間隙和骨量與正常的小鼠關(guān)節(jié)無異。
　　 5 TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+

24、Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制破骨細(xì)胞生成的機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)設(shè)立OCPs陽(yáng)性對(duì)照組，和iTregs組，在iTregs與OCPs共培養(yǎng)組中分別加入同型對(duì)照(cIgG)組、抗TGF-β單抗組和抗IL-10R抗體組，觀察iTregs是否通過TGF-β和IL-10信號(hào)途徑發(fā)揮對(duì)破骨細(xì)胞生成的抑制作用；同時(shí)設(shè)立雙層細(xì)胞培養(yǎng)板實(shí)驗(yàn)，觀察iTregs對(duì)破骨細(xì)胞的抑制是否為細(xì)胞接觸所依賴的；另外設(shè)立OCPs組、Tcon組和iTregs組，收集細(xì)胞，提取總蛋白

25、，Western Blotting檢測(cè)各組NF-κB亞單位P65和P50的表達(dá)水平，明確iTregs是否通過NF-κB途徑發(fā)揮其抑制作用。
　　 5.1 TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞生成的抑制為細(xì)胞接觸而非細(xì)胞因子接觸所依賴的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在加入了抗TGF-β和IL-10R中和抗體后，并未影響iTregs對(duì)破骨細(xì)胞生成的影響；但雙層細(xì)胞板實(shí)驗(yàn)顯示，iTregs一旦與OCPs分離培養(yǎng)，即無法

26、抑制其分化成破骨細(xì)胞，提示，iTregs的抑制作用為細(xì)胞接觸所依賴的。
　　 5.2 TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過NF-κB信號(hào)途徑發(fā)揮對(duì)破骨細(xì)胞生成的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，iTregs與OCPs共培養(yǎng)組，NF-κB亞單位P65和P50的表達(dá)水平顯著低于Tcon組及OCPs陽(yáng)性對(duì)照組。
　　 小結(jié)
　　 結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，iTregs在免疫缺陷和正常小鼠體內(nèi)環(huán)境下，都具有很好的穩(wěn)定性

27、，與nTregs相似；但在已發(fā)病的關(guān)節(jié)炎小鼠的炎性體內(nèi)環(huán)境下，nTregs易于凋亡并向Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化，同時(shí)還喪失了其對(duì)T淋巴細(xì)胞的抑制力；與之相反的是，iTregs能穩(wěn)定存在，并維持了其對(duì)T淋巴細(xì)胞的抑制功能。此外，iTregs對(duì)CIA小鼠關(guān)節(jié)的保護(hù)作用，一定程度上得益于其對(duì)破骨細(xì)胞生成的抑制作用，從而減少了破骨細(xì)胞引起的骨質(zhì)侵蝕和破壞；iTregs對(duì)破骨細(xì)胞的抑制為細(xì)胞接觸和NF-κB信號(hào)途徑所依賴的，并且表現(xiàn)為iTregs劑量相關(guān)

28、性的。綜合以上研究，所得結(jié)論如下：
　　 1.在體外，iTregs具有與nTregs相似的Foxp3的表達(dá)和對(duì)效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的抑制能力。
　　 2.對(duì)CIA小鼠，iTregs具有與nTregs相似的預(yù)防發(fā)病和減輕關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的作用。
　　 3.iTregs而非nTregs能保持對(duì)已發(fā)病關(guān)節(jié)炎小鼠的保護(hù)作用。
　　 4.iTregs對(duì)已發(fā)病的關(guān)節(jié)炎小鼠的治療作用的可能機(jī)制如下：
　　 1).在體

29、外促炎癥因子IL-6存在的情況下，iTregs仍可保持其抑制力，而nTregs則喪失了大部分的抑制力。
　　 2).在體外，iTregs而非nTregs可以抑制Th17細(xì)胞的分化。
　　 3).在免疫缺陷和正常體內(nèi)環(huán)境下，nTregs和iTregs具有相似的穩(wěn)定性。
　　 4).在炎性環(huán)境下，iTregs而非nTregs穩(wěn)定存在，且能顯著降低促炎癥因子IL-17A的水平。
　　 5).iTregs通過抑制